PCR 核酸检测技术原理和案例分析
首先我们需要知道：就现有检测手段来说，检测的是样品中病毒核酸片段，而非完整的病毒核酸，更不是活病毒。新冠患者治愈后，活病毒被免疫系统清除，但是体内可能仍然存在病毒核酸碎片，因此核酸检测结果仍可能呈阳性。此时的阳性结果，不代表患者体内一定存在完整的病毒核酸或者活病毒！
目前核酸检测主要的操作是，采取咽拭子或鼻拭子，取样后，做病毒核酸的实验室检测：提取标本中的 RNA，并逆转成 cDNA，用病毒 cDNA 的特异性引物进行 PCR 扩增。如扩增的产物，出现病毒特异性的 DNA，则病毒核酸检测结果为阳性。
新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 是一种 RNA 病毒，新冠病毒患者样本含病毒的遗传物质 RNA，核酸检测大概率呈阳性。(核酸结果阴性也不能排除病毒感染，要结合症状、血常规及肺部 CT 等检查，逐一分析，综合判断。）
PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)：基本原理类似于 DNA 的体内复制，特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。新型冠状病毒是一种 RNA 病毒，所以我们主要介绍一下 RT-PCR。
RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链式反应) 提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 为模板，采用 Oligo(dT) 或随机引物，利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
基于 RT-PCR 进行的核酸检测[1]
RT-PCR 可以定性，但不能定量。所以这里我们需要介绍一下它的升级版——实时荧光定量 PCR (Real-time RT-PCR)，就是结合了荧光定量技术的反转录 PCR：先从 RNA 反转录得到 cDNA，然后再用 Real-time PCR 进行定量分析。在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程。最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过 Ct 值对模板进行相对定量分析。
◐ 实验设计：
分别以 SYBR Green qPCR Master Mix、Primer 和 ddH2O 点样跑电泳。
◐ 问题：
为什么单独用 Mix 跑核酸电泳会有一个小条带？
◐ 萌 Cece 解答：
此款 qPCR Mix 所用的酶为配体法修饰的热启动 DNA 聚合酶，该配体为核酸。因此直接用酶跑电泳时，会存在一个小条带。
收！说了这么多，讲重点！针对核酸检测中的假阴性问题，有没有完美的解决方案呢？
额~目前还没有新冠检测筛查金标准。所以联合检测手段是目前比较可靠的方式，即同时应用 2 种或 2 种以上诊断方式来检测。目前的检测手段有鼻拭子和咽拭子、肺泡灌洗液检验、血液抗体检测、粪便和肛拭子，及胸片/CT 等影像学等手段，还可以结合环境样本和阴性对照做验证排除。
做 PCR 时出现假阴性是什么原因呢，又该怎么应对？别担心，萌 Cece 有妙招！
■ 问题 1：模板问题
萌 Cece 分析解答：模板可能包含杂蛋白。建议配制稳定有效的消化处理液。同时，模板的溶解液固定不变 (比如：Tris-HCl 缓冲液)。
■ 问题 2：引物问题
萌 Cece 分析解答：引物可能质量不太好，或者浓度设计不合适，及引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。建议更换引物。引物应高浓度小量分装保存，以防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效。
■ 问题 3：Mg2+ 浓度
萌 Cece 分析解答：Mg2+ 浓度对 PCR 扩增效果影响极大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败，出现假阴性。建议设置一组反应，每一反应中的其他离子浓度相同 (如 Tris、KCl 等)，而 MgCl2 浓度不同，来摸索最佳浓度。
■ 问题 4：设计因素
萌 Cece 分析解答：变性温度低，时间短；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低扩增效率；延伸时间过短。建议提高变性温度，延长变性时间，尤其首次循环。退火温度应根据 Tm 值来设定。延伸时间必要时适当延长。
除此之外，就是最讨厌的“出现非特异性扩增带”
萌 Cece 分析解答：Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，PCR 循环次数过多；酶的质量不过关；引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体，都有可能出现非特异性扩增带。建议适当提高退火温度；更换新酶；降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数。必要时重新设计合成引物。
说这么多就不得不提一下我们 MCE 众多的 Pre-Mix 即用型预混液，操作 so easy！
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参考文献
1. Nidhi Verma, et al. Emerging diagnostic tools for detection of COVID-19 and perspective. Biomed Microdevices. 2020 Nov 24;22(4):83.
2. Wenling Wang, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020 May 12; 323(18): 1843-1844.
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