PCR是分子生物学中常用的实验技术手段,在揭示生命现象规律方面发挥了至关重要的作用。目前在进行PCR实验操作时,因为PCR反应体系设计不合理而导致实验失败的事例较多。因此,从优化PCR反应体系的角度出发,对提高PCR反应效率进行探讨。 一、PCR反应体系: 一个常规PCR反应体系一般选用25~50 µ1体积,其中含有: 实际上,常规PCR体系通常含有:50mmol/L KCl(对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的)、10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)、1.5mmol/L MgCl2。商品化的Taq DNA聚合酶时,一般均带有PCR缓冲溶液储存液,在设置PCR反应时,按PCR缓冲溶液的终浓度进行稀释。需要提醒的是MgCl2 , 有些公司提供的PCR缓冲液中已经含有适当浓度的MgCl2,此时无需在常规的PCR体系中另外添加;但是有些公司的PCR缓冲液中不含有Mg2+ 而是提供独立包装的MgCl2,以便使用者在设置PCR反应体系时,能够按照个性的实验设计要求来添加。 二、PCR体系优化: 1、Mg2+浓度: 镁离子(Mg2+)作为DNA聚合酶活性的辅助因子,有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外, Mg2+能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷,从而促进引物与DNA模板形成复合物。 通常情况下,Mg2+以MgCl2的形式提供。但是,因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能,诸如Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶选MgSO4。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA(如果存在)结合,因此,通常需要对镁离子浓度进行优化,以尽量提高PCR得率,并保持其扩增特异性。 在PCR中,标准的Mg2+终浓度范围为1~4 mM,建议优化滴定增量为0.5 mM。Mg2+浓度过低会降低聚合酶活性,导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面,Mg2+浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性,产生非特异性PCR产物,并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。 2、退火温度: 一般低于Tm的5℃左右,退火温度太低会发生错配,可以通过梯度退火温度PCR仪来优化反应的退火温度,即在正式实验前,在确定了其他反应参数的情况下,按照实验的需要, 设置适当的梯度退火温度, 以0.5℃递增进行(如50.5、51.0、51.5…), 优化出最适退火温度。 3、促进剂: 在PCR体系中加入一些适当浓度的辅助物,如DMSO(二甲基亚砜)、PEG-6000 (聚乙二醇6000 )、甘油、 甲酰胺、非离子去污剂等,以降低碱基错配率或提供PCR的扩增效率。这些辅助物即为PCR促进剂。大多数的PCR促进剂在高浓度时会抑制PCR,因此在具体实验中,应根据PCR反应体系中特定的模板和引物的结合情况,选择PCR促进剂的最适浓度,但也会存在抑制。 4、引物设计: 需要花一整天来讨论的恐怕就是PCR引物的设计了,包括引物长度、GC含量、Tm值、二聚体等等…… 在这里,我就简单地介绍优化引物浓度。如果添加过多的引物,会增加非特异性结合和引物二聚体。引物浓度推荐设定为0.2uM的较低水平效果会好很多。为了提高特异性,引物浓度甚至可以降到0.1uM,但是可能会减低PCR产量。 5、变性温度: 变性温度过高或变性时间过长都会导致DNA聚合酶活性的丧失,从而影响PCR产物的产量。变性温度过低或变性时间过短则会导致DNA模板变性不完全,使引物无法与模板结合同样会导致PCR反应的失败。通常情况下,95℃变性20~30秒即可使各种DNA分子完全变性。 6、延伸条件的优化: 延伸温度取决于所用的DNA聚合酶的最适温度,通常为70~75℃。延伸温度要求比较严格,一般不可随意更改。有时延伸温度相差1℃就可导致PCR反应的失败。延伸时间取决于扩增片段的长度。目的片段小500bp时,所需延伸时间为20秒;目的片段在500~1200bp时,延伸时间需40秒;目的片段大于1200bp时,则还需增加延伸时间。另外,还可以 500 bp/30秒为基准,根据目的片段的长度计算反应时间。目的片段小于150bp时可以省略延伸步骤,因为退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列的合成。 7、循环次数: PCR反应的循环次数主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次,此时PCR产物的累积可达到最大值。随着循环次数的增加,一方面由于产物浓度过高,自身发生结合而不与引 物结合导致扩增效率的降低;另一方面,随着循环次数的增加,DNA聚合酶活性下降,引物与dNTP浓度也下降,会出现“平台效应”,也容易发生错误掺入,使非特异性产物增加。因此在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。 8、热启动PCR: 将PCR反应混合物置于低千Tm值的温度下时,在极短的时间内即可产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。这种方法是在加入DNA聚合酶之前,先将PCR反应体系升温至95"C,预变性2~5分钟后,将仪器设在暂停,在这一高温条件下迅速加入DNA聚合酶后再恢复循环。热启动可以防止模板变性不充分,同时还避免了DNA聚合酶活性的迅速下降。 9、模板: 含有靶序列的模板DNA可以单链或双链形式加入PCR反应体系中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素,但当使用高分子量的DNA(>10kb)作模板时,如用限制性内切酶先行消化(此酶不应切割其中的靶序列),则扩增效果更好。在PCR反应各项条件控制最佳时,仅单拷贝的靶序列作模板也能获得满意的结果,然而更多的情况是靶序列DNA的几千个拷贝数的模板量加人反应体系中。用哺乳动物基因组DNA作模板时,每个PCR反应所加入的模板约为1.0µg DNA, 它相当于常染色体单拷贝基因的约3*l05拷贝数的DNA量。酵母、细菌与质粒DNA作为PCR模板时,每个反应中典型的模板量依次是10 ng,1ng和lpg。 今天小编主要给大家分享了PCR实验优化的几点内容,希望能给读者贡献参考。 武汉华美生物工业原料事业部提供优质的单克隆抗体、多克隆抗体、诊断蛋白、生化酶、分子生物学产品以及通用原料,同时可以为客户提供oem试剂及专业的定制化服务。产品全面覆盖炎症标志物、心肌标志物、肿瘤标志物、肝功肾功、甲功激素、自身免疫疾病、呼吸道病原体、动物传染病等领域;广泛应用于免疫比浊、免疫层析、酶联免疫、化学发光、临床生化和分子诊断等平台。可为广大体外诊断试剂厂商提供一定量的免费试用装,赶紧联系我们哦! 需要了解更多信息,请与我们联系: QQ:3149924161 邮箱:market@cusag.cn 网站:www.cusag.cn 我们将一如既往地为您提供高品质抗体、抗原原料和更好的服务,助力诊断,我们一直都在! |
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