PDA TR82（五）：LER的缓解措施

写在前面的话：建议进行细菌内毒素检查方法开发前就进行该部分的学习，然后再进行方法开发提前采取措施或避坑，避免采取方法后发现存在LER然后再进行LER研究。LER研究有点类似于PDCA的过程。

5.0概述

内毒素的结构图，制定缓解策略需要了解LPS结构

即使按照药典方法对稀释后样品进行干扰实验的回收率满足要求，但如其产品的LER hold-time研究中产品的回收率不满足研究要求，仍认为存在LER现象。

当样品放置时间中两个连续时间点的回收率均未达到50%或更低时会被认为发生了LER LER occurs when two consecutive time points fail to achieve 50% or greater recovery in a hold-time study）。因此确保有足够数量的样品是制定缓解策略的一个最基本要求，以便可以通过增加额外的时间点评价研究结束时回收率低于50%的单个时间点，以确定是否发生LER。

另外一种直接缓解方法可能是对相关步骤中的中控样品进行取样并进行细菌内毒素检查。消除抑制或增强干扰的传统方法简单有效且被广泛认同，这些方法也可能用于解决LER（例如：存在抑制剂的时候）。

本章节中提出的缓解措施是基于以下LER现象是由以下因素引起的假设基础上提出的：

（1）蛋白质产品本身结合或者扰乱加标内毒素的物理状态（超分子）和或（2）一种同时含有缓冲液（如枸橼酸盐）和表面活性剂（如聚山梨酯）的特定辅料组合。

如4.0节所述，LER的可能原因是因为内毒素超分子的改变导致内毒素不能被检测到，特别是其稳定性受二价阳离子影响的内毒素（包括CSE和RSE）。因此逆转LER的缓解策略可分为两类：(1)改变样品处理方式或者测试方法来实现加标内毒素的回收；和（2）采取额外更复杂的程序来解决实验已尽力但无法克服的LER现象。

5.1.通过样品处理方法优化来缓解

应首先检查传统用于解决细菌内毒素检查过程中抑制（当干扰因素试验中PPC回收率 < 50%时）的方法（例如，样品pH值、避免已知抑制剂、吸附在塑料制品上、未充分混合）。许多LER问题可以通过参考现有指南进行合理研究设计来解决，或通过持续关注第3.0节中描述的样本处理和典型分析问题来找到解决问题的方法。此外，结合制剂缓冲液和LPS回收温度了解产品本身的潜在影响是重要的。建议按以下顺序进行以下操作，以便保证最实用和最简单的可能解决方案先被研究（It is recommended that the following approaches be performed in sequence, so that the most practical and straightforward of the potential solutions are studied first）。如果这种方法不成功，可以考虑将单独的策略进行组合。

5.1.1.产品评估

因产品结合内毒素引起低内毒素回收通常是因具有疏水性或电正性结构（例如，带正电荷的聚集体可以与带负电荷的内毒素结合）的蛋白质（产品中的活性成分）引起。

蛋白质的等电点(pI)不是LER倾向的可靠指标，因为所有蛋白质均为两性离子和存在净电荷（如果已知），可能是特定蛋白质上特定区域的问题。因为这个原因，将样品的pH值调节至LAL试剂生产商（按照药典细菌内毒素检查要求)推荐的pH值范围以外（LAL试剂和待测溶液的混合溶液pH为 6-8）是无益的。然而，在开始以下矫正低LER的步骤之前，获得关于蛋白质净电荷和疏水性的信息是必要的。

4.0节建议将产品与制剂组分分开进行研究。当怀疑LPS与产品结合时，可查阅文献以获得潜在的解决方案(33)。

5.1.2.向样品中加入分散剂

在某些情况下，向样品中加入分散剂可以解决细菌内毒素检查过程中的回收问题；因此，分散剂可能能够克服LER。这些试剂为市售试剂（例如，PY-ROSPERSE™、Endo-RS®、CRL BD100®），尽管其组成是专有保密的，但可以利用实验的方法利用各种体积组合、不同时间、不同温度和不同混合方案来评价这些试剂是否克服LER。如果成功，在QC产品测试实验室中可以相对容易地对使用专用分散剂的测试方法进行方法验证。

5.1.3.添加过量的二价阳离子

（螯合反应，图片来源于网络仅供学习交流）

在某些情况下，过量的Mg + 2可解决LER问题(58，59)。另一种成功率有限的方法是降低含柠檬酸盐样品的pH值，以削弱螯合反应。基于官能团的pKa，无法通过降低磷酸盐缓冲液pH值来获得收益。了解受螯合缓冲液与表面活性剂联合影响LER的情况有助于从缓冲系统获取信息判断其对LER的影响。（Generally, situations known to be affected by chelating buffers in combination with surfactants may benefit from knowledge of the buffer systems and their impact on LER.）。

5.1.4.其他样品处理方式

对于高亲脂性或带正电荷的LPS被吸附到产品上的情况可能需要采用其他样品处理方式（而不是通过调节pH和添加分散剂）提高回收率。例如，加入含有机溶剂（如异丙醇）的疏水性的溶或加入其他具有疏水性的物质（例如牛血清白蛋白）在个别情况下（in rare cases）可提高回收率。

使用蛋白酶K在最适温度下孵育使蛋白质水解的方法在极罕见的情况下可以可改善加标LPS的回收率(33)。

此外，虽然可以通过很多方式沉淀蛋白质，但在被处理时会与与蛋白质同时沉淀导致无法回收。

处理过程中添加的试剂需要无热原（In all these scenarios, the lack of con-taminating endotoxin in the added reagent needs to be ensured）。

这些LER潜在解决方案是经验性的；已知没有一种解决方案对任何类别的产品或制剂有效。

5.1.5.鲎试剂灵敏度的评估Evaluation of LAL Assay Reagents LAL

如样品处理后仍不能缓解LER的情况，应评价其他商业LAL技术。在某些情况下，使用专有的鲎试剂、试剂和供应商材料可能解决回收问题。尽管这是经验之谈，但这可能是一个快速的解决方案。如果使用与产品放行不同的鲎试剂和标准品不同的LAL试剂作为LER溶液用于解决LER时，，需要对鲎试剂进行质量确认（见8.9节）（if a lysate or standard other than that used for release-testing is needed to resolve LER, this may require additional effort to qualify LAL reagents .）。

也可考虑使用来自不同供应商的市售试剂盒（例如动态/终点、浊度/显色、凝胶法），尤其是在5.1.4节下的样本处理方法仍不能有效解决LER时；这些试剂盒使用前需要进行质量评价（should be evaluated early）。与细菌内毒素检查实验一样，实验用材料（ materials）需经RSE使用适宜的CSE/鲎试剂组合进行标定（As with the BET test, using only materials calibrated to RSE with appropriate CSE/lysate combinations is important.）。

如使用不同的鲎试剂用于解决LER问题，则需要使用相同的鲎试剂用于放行而且需要用心的鲎试剂进行全面验证（If use of a different LAL reagent is the solution to LER, the same CSE/lysate combinations should be used for the BET drug product release testing, which would require full validation with the new reagents. ）。

5.1.6.非鲎试剂的细菌内毒素检查方法

在某些情况下，在LER研究中对LAL以外的其他技术进行了评估。在一个示例中，用重组因子C法进行对样品进行放置时间研究时也呈现了LER现象（见第8.9节）。尽管在这种情况下重组因子C未改善回收率，但该选择也应与LAL方法一起评价(60)。

5.2.通过生物系统来评估

如果章节5.1中建议的缓解措施失败，如果使用生物系统检测加标内毒素样品则可能得到解决LER问题。使用LER hold-time研究后的样品按药典规定的热原检查法（第3.0节）测试后将产生两种可能的结果：热原或非热原。

当发现内毒素加标或放置研究的产品样品具有热原时，生产厂家在开发出适宜的体外检测方法前均需应使用家兔热原测试（Rabbit pyrogen test，RPT）作为QC临时放行检测方法。有效的体外内毒素检查的开发和实施可以作为上市后承诺。因RPT的不敏感性和变异性，鼓励制药公司在BLA批准后尽快实施体外内毒素检查方法代替RPT用于制剂的放行。在不鼓励使用动物进行试验或无法获得使用家兔进行检测的适宜设施的国家，采取细菌内毒素检查法被证明时特别有益的（Performing the endotoxin test could prove especially beneficial in countries where animal use is strongly discouraged and contract facilities for testing in rabbits are not available）。

当内毒素加标或进行放置研究的样品未发现热原时，可能不需要对产品放行进行热原检查（When endotoxin-spiked or -held product samples are not found to be pyrogenic, a pyrogen test for product release may not be required.）。应优先对配方中引起LER的组分进行额外的过程内毒素检测（如已知）。控制原材料的内毒素检测至关重要，这些材料可能影响成品中的最终内毒素负荷。所有后续加工步骤的微生物控制策略时至关重要的，这些措施有利于对保证成品中的内毒素处于低水平。

最后，在美国FDA审评时建议生产商做出评估LER缓解策略并开发、验证和实施不受LER影响的体外内毒素检测的上市承诺。（在欧洲药典中描述了一个此类示例，单核细胞活化试验。2.6.30，并在第5.2.3节中讨论。）

原文：Finally, a post-marketing commitment to evaluate LER mitigation strategies and to develop, validate, and implement an in vitro endotoxin test not subject to LER may be recommended for the release of the finished drug product after U.S. FDA approval.

使用家兔进行热原检查存在很大挑战，因LPS的来源和质量会导致不同家兔热原检查研究的灵敏度出现巨大差异。样品处理、内毒素的来源和剂量水平、家兔种群的基因型和繁殖以及动物处理等因素都可能引起以上差异。5.3节提供了家兔热原试验的研究设计和分析方案，，并提出了建议该如何进行替代试验评估，例如第5.2节中引用的体外试验。

5.2.1.细菌内毒素的剂量

每一种被使用的细菌内毒素溶液都必须进行检测，其含量应能够引起发热反应（不符合药典热原试验的要求，根据体温升高该试验采用特定的数据处理算法确定“符合要求”或“不符合要求”）。众所周知，RSE是一种高纯度标准物质。如果使用其他内毒素制剂，则需要在动物实验中评价确定其热原相当量（If other preparations of endotoxin are used, they will need to be evaluated carefully in animals to define the pyrogenic dose.）。

尽管研究表明，当在1小时内给药5 EU/kg时会引起热原反应，但实际上并未出现热原反应（如，在家兔体内）(61,62)。在家兔体内可能需要更高的细菌内毒素水平（例如，40 EU/kg）才能引起热原反应(63-65)。基于这些发现，推荐35-40 EU/kg的剂量作为使用RSE加标后的剂量。由于动物伦理问题，使用其他来源细菌内毒素进行更广泛研究的申请可能不会被批准。因此，以下指南使用不小于35 EU/kg（不符合药典热原试验要求）剂量的RSE。开展动物试验相关困难和RPT试验缺乏敏感性是首选体外试验作为替代方法的原因，如5.2节所述。

5.2.2.产品剂量

在动物试验或体外研究时需要考虑的另一个主要因素是被测试产品的剂量。用未加标的产品使用家兔按传统的热原检查法进行热原检查时，给动物服用的药物量应相当于人体受试者每千克体重的最大剂量。例如，给体重50-100公斤的人体受试者皮下注射1毫升150 mg/mL的固定剂量的药品，其计算方法如下:

计算方法如下：

150 mg/50 kg（最小患者）= 最大暴露量3 mg/kg

在药典家兔热原检查法中，不建议极小体积给药，而且这样也不实际，因此给药前前需要稀释。用于LER研究样品需使用“纯品”（即未稀释）进行加标使得问题变得复杂。基于假定人体给药剂量3 mg/kg活性药物成分（含目标35 EU/kg内毒素），家兔热原试验给药溶液的LER放置时间和制备指南如下：

1.1.使用150 mg/mL蛋白样品

2. 用1 mL LRW复溶RSE(10,000 EU)，得到10,000 EU/mL细菌内毒素溶液

3. Combine and mix 0.876 mL (876 μL) of stock RSE with 5 mL of protein sample

将0.876 mL(876 μL)RSE贮备液和5 mL蛋白样品混合

a. (10,000 EU/mL) * (0.876 mL/[0.876+5.0 mL]) = 1491 EU/mL

b. (150 mg/mL) * (5.0 mL/[5.0 mL+0.876mL]) = 128 mg/mL

4.如果样品需要放置3天，对开始时间(T0)和结束放置后样品检测这些样品

a. 取0.78 mL加标LRW或样品，加至99 mL PBS中稀释

b.蛋白质浓度 = (128 mg/mL) / (0.78 mL/[0.78 mL + 99 mL]) = 1.0 mg/mL

c. RSE浓度 = (1491 EU/mL) / (0.78 mL/[0.78 mL + 99 mL]) = 11.6 EU/mL

d. 给一个3千克的家兔给药9mL上述溶液（按4a-4d制备）

e. 检查

i. 1.0 mg/mL 蛋白质 * 9 mL = 9 mg 蛋白质

• 9 mg/3 kg = 3 mg/kg 蛋白质剂量

ii. 11.6 EU/mL RSE * 9 mL = 105 EU

• 105 EU/3 kg = 35 EU/kg RSE 剂量

f. 基于家兔重量计算, 家兔热原测试给药剂量为 3 mL/kg

在动物中进行LER研究之前，确保家兔热原测试中的未加标样本无内在热原（Before conducting LER studies in animals, ensure that the unspiked sample in the RPT is not inherently pyrogenic.）。在5.2.3节进行MAT试验时也应进行相同的操作。RPT和MAT （单核细胞活化试验）进行LER研究的数据分析在第5.3节讨论。

5.2.3.单核细胞活化实验

（单核细胞图，图片来源于网络，仅供学习交流用）

单核细胞活化试验(MAT)可作为家兔热原试验的体外替代方法，进行MAT实验也需要获取产品用药剂量信息和进行合理的方案设计。方选择和方案设计时MAT试验至关重要的一部，可参考欧洲药典2.6.30。虽然在LER回复研究时可能需要进行一些改变，欧洲药典2.6.30对MAT方法的开发和控制给出了极好的指导（While some variation may be needed during an LER remediation study, the development and controls recommended in Ph. Eur. 2.6.30 are, for the most part, an excellent guide for MAT applications）。

上述RPT展示的研究设计示例（第5.2.2节）也可用于阐明（ illustrate）LER应用（application）。应确定使用的内毒素的确切来源（来自人血液的肝素化人全血或外周血单核细胞制备物），并使用LRW进行一系列内毒素稀释来筛查供体。

5.2.3.1.供体选择与集中

人体对相同的内毒素制备物表现出高度变异性，对不同来源的内毒素表现出不同的敏感性。因此，建议预选足够数量的供体来源（或供体池）用于LER评价中进行测试开发和内毒素检测。通常进行10倍稀释（例如，在微量滴定板中将20 μL样品与180 μL血液加至微孔中）得到取约1 EU/mL的溶液用于测试，测试用样品的响应应产生比背景高至少一个数量级（Typically, a solution of about 1 EU/mL, when diluted 10X (e.g., 20 μL into 180 μL of blood per well in a microtiter plate) should give a response of, at least, an order of magnitude above background）。

检测限有时会定义为背景测试结果的3倍，背景测试结果会因供体不同而出现差异故应在检测前进行评估。

需要测量多种细胞因子表达的时程来选择产生促炎性细胞因子水平（通常为IL-1、 IL-6或IL-8）所需的条件和时间，促炎性细胞因子水平至少是背景的3倍，并且在规定的时间范围内未达到最大反应（之前在课程研究）。测试结果应在在细胞因子标准曲线范围内对于LER研究恢复非常重要（碎碎念：标曲以外无法定量）。证明在这些条件下可获得可重现的结果，即可采用该方法进行LER研究（原文：The LER study can be designed once these conditions are demonstrated and reproducible results can be obtained.）。

5.2.3.2.样品制备

产品剂量示例(1491 EU/mL)中样品的细菌内毒素含量太高无法用于MAT，因此需在加入细胞前需要进行一系列稀释，以达到所需的内毒素目标浓度（the desired target endotoxin assay concentration）。按照第5.2节中的RPT示例，可将68 μL含1491 EU/mL的样本加入10 mL稀释剂中进行稀释以得到内毒素浓度为10.1 EU/mL的溶液。将上述溶液在血液或外周血单核细胞(PBMC)中进一步稀释10倍后，该浓度非常接近目标值1 EU/mL。通过直接比较LRW中诱导的细胞因子与加标至纯产品中的细胞因子，可在MAT中监测LER。因此，加标LRW对照的50%-200%回收率与初始BET放置时间LER研究的回收率相似。

5.2.3.3.细胞系选择

培养的稳定细胞系（例如过表达TLR4的HEK-293/TLR4）可使得在MAT实验中得到比病原分子相关模式（Pathogen-associated molecular patterns，PBMC）或全血肝素化更稳定的结果（more consistent results）。使用细胞系时所需的方法开发与5.2.3.1节中描述的相似。由于已消除供体变异性，因此在使用相同内毒素标准物质进行LER研究开发时的重点工作是优化剂量水平和试验条件。在选择细胞系时应注意：大多数市售细胞包括结合内毒素的分子组分（例如TLR4、MD2和CD14）且会转导信号并产生反应。理想情况下，应使用仅表达一种TLR（Toll-like receptor，Toll样受体）的细胞，因为其他TLRs的内源性水平可能导致LPS缺乏特异性（例如，TLR5被鞭毛蛋白激活）。与原代细胞（例如全血或PBMC）一样，不存在LER现象的接受标准为与LRW阳性对照对比回收率应在50%-200%范围内(66)。这些细胞系通常需要抗生素来维持选择性压力来表达所需的TLR（原文：As with primary cells (e.g., whole blood or PBMCs), the criteria confirming a lack of LER is 50% to 200% measured against an LRW control (66). These cell lines often require antibiotics to maintain selective pressure to express the desired TLR.）。

5.3.结果判断

提供的两个选项（USP<151>热原试验和MAT）可应用于测试同法处理的样品（时，可能需要调整加标水平。除此以外，根据药典中的限度将RPT数据判读为“符合要求”或“不符合要求”。关于MAT或细胞系中的响应，如果回收率超出50%-200%范围则认为存在LER现象。总之，产品中加标内毒素符合要求而LRW中加标物不符合要求的样品被解释为与LAL试验不一致。

5.4.总结

LER缓解的目标是对采用细菌内毒素检查法在放置时间研究中发现存在LER的情况进行有效管理，以最大限度地降低制剂中未检出内毒素的风险。在问题未彻底调查且LER问题持续存在的情况下，建议采取的行动方案是对所有材料进行细菌内毒素检查（通过BET），直至将生产工艺中添加了解决LER的组分，如第5.2节所述。

原文：The goal of mitigation is to manage situations where LER is observed by BET in hold-time studies in a manner that minimizes the risk of undetected endotoxin in drug products. In cases where the problem has been thoroughly investigated and the LER problem persists, the recommended course of action is to thoroughly test all materials (by BET) up to the point at which the components responsible for the LER are added into the manufacturing process, as described in Section 5.2.

其他部分传送门：

PDA TR N0.82（二）：术语、前言和目录 - 博普智库 (bopuyun.com)

PDA TR82（三）：LER Hold-Time 研究试验方法 - 博普智库 (bopuyun.com)

PDA TR82（四）：被提出的LER各种作用机制 - 博普智库 (bopuyun.com)