巢式PCR

常规PCR在对模板进行扩增的过程中，引物与模板之间会出现非特异性配对，导致产生非特异性产物。为了提高PCR扩增的特异性，人们对常规PCR进行技术改良，发明了巢式PCR（nested PCR）。

巢式PCR是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，第二轮的扩增产物才是目的基因片段。巢式PCR的实验原理为根据DNA模板序列设计两对引物，利用第一对引物（称为外引物）对靶DNA进行15-30个循环的标准扩增（见图1）；第一轮扩增结束后将一小部分起始扩增产物稀释100-1000倍加入到第二轮扩增体系中作为模板，利用第二对引物（称为内引物或巢式引物，结合在第一轮PCR产物的内部）进行15-30个循环的扩增（见图1），第二轮PCR的扩增片段短于第一轮。

巢式PCR原理

图1：巢式PCR扩增流程

与常规PCR技术相比，两套引物的使用提高了扩增的特异性，因为和两套引物都互补的靶序列很少。如果第一次扩增产生了错误片段，内引物与错误片段配对扩增的概率极低，因此提高了PCR扩增反应的特异性与灵敏度。

巢式PCR特点

克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性；
由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；
内测引物扩增的模板是外侧扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因此可以保证整个反应的准确性及可行性。

注意事项

巢式PCR的注意事项与常规PCR基本相同。除此之外，巢式PCR实验还需要注意两轮扩增引物的比例：如果第一次引物过量的话，剩余引物第二次PCR扩增的时候同样能有一定的产量，这对于第二次PCR反应而言就是非特异性的产物。在第一次PCR时，应尽量摸索引物最低的加入量，同时适当增加循环次数，尽量消耗体系中的残余引物。

常见的巢式PCR技术

除了常规巢式PCR外，巢式PCR还有多种形式的扩展，下面分别做一介绍：

半巢式PCR

巢式PCR是利用第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板，除使用第一轮的一对特异引物之外，在第二轮PCR反应中使用一对新的特异引物，共使用四条特异性引物进行DNA扩增。半巢式PCR与巢式PCR原理相同，只是在第二轮PCR反应中使用的引物有一条为第一轮PCR的引物，这种利用三条引物进行两次PCR扩增的方法称为半巢式PCR( semi-nested PCR)。

在一些需要利用巢式PCR进行扩增的实验中，如果基因的3’末端或者5’末端无法设计出两条引物，可以使用半巢式PCR。

反转录巢式pcr

反转录巢式PCR( RT-nested PCR)是在反转录PCR的基础上发展起来的，在通过反转录获得cDNA的基础上，对目的基因进行巢式PCR扩增。它和简单的反转录PCR一样是用于检测某种RNA是否被表达或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强，可用于拷贝数较低的RNA的扩增，例如扩增丙型肝炎病毒(HCV)感染者体内的HCV基因。

单管巢式PCR

单管巢式PCR是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物为25bp，退火温度比较高(68℃)；巢式内侧两个引物为17bp，退火温度较低(46℃)。通过控制退火温度(68℃)使外侧引物先行扩增，经过20~30次循环后(第一轮PCR结束)，再降低退火温度(46℃)使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增。单管巢式PCR两轮PCR反应均在一个PCR管中进行，减少了交叉污染的可能性。

共有序列巢式PCR

共有序列巢式PCR( consensus nested PCR)，又称为共有引物巢式PCR( consensus primer nested PCR)，根据同一种属内较为保守的序列设计简并引物，通常第一轮PCR引物的简并碱基较多，第二轮PCR引物的简并碱基较少一些，扩增长度为200~300bp。引物通常设计在能够区分微生物的不同亚型的区域内。对于某一种生物，例如病毒，种属内型别很多，但检测样本中的病毒型别又不确定，使用共有序列巢式PCR扩增获得目的序列，进而通过测序获得未知微生物的信息，是一种敏感而又简便易行的检测方法。

共有序列巢式PCR引物设计尤为重要，在引物设计之前要搜集可能相关的所有DNA序列，利用软件进行严格的序列对比分析，从中找出保守的序列，在这部分序列中可能仍存在一些核苷酸的多样性，则在具有多样性核苷酸的位置上设计为简并碱基，将所出现的所有核苷酸多样性均要考虑，第二轮PCR扩增产物长度控制在200~300bp左右。由于引物中简并碱基较多，要摸索适合的退火温度。

巢式PCR应用

巢式PCR大多应用在当模板DNA含量较低时，用一次PCR难以得到满意的结果，这时用巢式PCR的两轮扩增可以得到很好的效果。

巢式PCR操作简单，所需条件与常规PCR相同，但与常规PCR相比进一步提高了反应的特异性与灵敏性，在微生物学、生物信息学、生物医学等方面有着极其广泛的应用。例如巢式PCR技术与RFLP（限制性片段长度多态性）技术结合，通过设计高度保守序列的引物对待检物种DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行RFLP分析，从而完成DNA分子水平上的多态性检测，该法常用于流行病学的调查和临床常规检测。