随着高通量测序技术的快速发展及多项免疫治疗相关临床研究的深入开展，结直肠癌的分子分型及免疫治疗相关标志物研究日益成为人们关注的热点。本文将从结直肠癌分子分型、免疫表型、PD-L1免疫组化结果判读及微卫星不稳定性等方面相关研究进展做简要论述。
一结直肠癌的分子分型及免疫表型
结直肠癌基因表型十分复杂，与日光照射导致的皮肤黑色素瘤及吸烟引起的肺癌类似，结直肠癌的体细胞突变频率非常高[1]。
图1. 各种肿瘤中体细胞突变频率
不同部位胃肠道肿瘤涉及的分子事件有所差异。如EBV病毒感染只发生在胃部，而微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）常见于远端胃及右半结肠[2]。
图2. 不同部位胃肠道肿瘤发生的基因改变
1. 结直肠癌的分子分型。
结直肠癌分子分型主要分为4型。CMS1-MSI免疫型（14%）：组织学常伴有大量淋巴细胞浸润。常伴有微卫星不稳定状态、CpG岛甲基化、BRAF突变率高及高频突变常见，复发以后生存时间短。CMS-2-经典型（37%）： 具有较高体细胞拷贝数变化、WNT及MYC通路激活常见。CMS-3-代谢型（13%）：显著的代谢失调，K-RAS突变频率较高。CMS-4-间质型（23%）：具有较高体细胞拷贝数变化，更为重要的是，该种亚型常有上皮-间充质转化（EMT）相关基因的上调、血管生成、TGF-β信号通路及间质重建通路的激活[3]。
图3. 结直肠癌分子分型
2. 结直肠癌的免疫分型
Thorsson 等依据巨噬细胞及淋巴细胞浸润情况、Th1:Th2 细胞的比例、肿瘤间的异质性、非整倍体、肿瘤新抗原的负荷、细胞整体的增殖情况、免疫调节基因的表达情况以及患者的预后，对33种肿瘤的10000多份样本的免疫基因组学数据进行分析，可以把肿瘤分为：创伤愈合型、IFN-y为主型、炎症型、淋巴细胞耗竭型、免疫静默型及TGF-β为主型。在此分型体系中，结肠癌与直肠癌免疫表型相近，与胃癌免疫表型差异显著[4]。
图4. 33种肿瘤免疫分型
二免疫治疗的生物标志物
精准医疗时代，如何选择免疫治疗生物标志物变得日益重要。下图所示为2017年ASCO会议展示的免疫治疗相关表型标志物及基因组学标志物[5]。其中PD-L1 IHC（免疫组化）及MSI状态是美国FDA获批的检测项目。
图5. 免疫治疗相关表型标志物及基因组学标志物
1. PD-L1（IHC）
PD-L1 表达是目前最为成熟的生物标志物。PD-L1 IHC结果判读根据所应用抗体的不同及针对人群的不同略有差别，但基本以阳性肿瘤细胞数（TCs）>5% 或阳性免疫细胞数≧1%为阈值，目前某些研究也采用CPS评分标准进行结果的判读，而且CPS 大于等于1可以富集潜在治疗获益的患者[6]。
图6. Keynote059应用22C3抗体染色后，CPS结果计算
PD-L1表达情况受多种因素影响。生物学方面包括：肿瘤的异质性，肿瘤不同阶段的动态变化；检测技术方面包括：不同的检测平台、不同的抗体、不同的阈值及不同判读标准；组织来源方面包括：石蜡标本或新鲜标本、原发灶或转移灶、组织标本的质量。以上因素均会影响PD-L1的表达及结果判读。
2. 微卫星不稳定性
MSI是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。发生机制主要包括DNA多聚酶的滑动导致重复序列中1个或多个碱基的错配和微卫星重组导致碱基对的缺失或插入以及点突变所致，当面对数十个突变碱基时，免疫系统则有很可能发现这些错误，并且通过免疫检查点抑制剂的作用，增加有效的免疫应答[7]。
基因错配修复缺陷（dMMR）的分子机制主要有两种：通过胚系突变导致功能性MMR蛋白缺失（Lynch 综合征）以及通过体细胞突变或沉默导致功能性MMR蛋白缺失。后续与其他基因改变如K-RAS，B-catenin及BRAF基因突变的效应叠加，导致结直肠癌的发生[8]。
图7. 导致dMMR的两种分子机制
MSI检测的临床意义有三点: 1. 用于Lynch 综合征筛查； 2. 用于结直肠癌患者预后及治疗指导。如：MSI患者生存期更长、病死率更低(不易发生肿瘤复发及淋巴结转移；5-FU 辅助治疗，使MSI-L和MSS患者受益。MSI-H患者不受益，5年生存率反而更低。所以计划单独使用5-FU进行辅助治疗的Ⅱ期结直肠癌患者需进行MSI检测。 MSI-H患者与MSS患者相比对伊立替康的治疗更为敏感； 3. 可作为PD-1抑制剂治疗的生物标志物[9，10]。
图8. MSI-H肿瘤激发机体免疫反应
如上图所示，新抗原可被加工、呈递，并可被T细胞识别为“外来物”。早期MSI-H结直肠癌的预后常优于微卫星稳定（MSS）结直肠癌，极可能因为该肿瘤亚型存在较高水平的新抗原和免疫编辑[11]， 早期即被机体免疫系统所识别，这也成为了免疫治疗相应潜在靶点。
Pembrolizumab治疗错配修复缺陷（dMMR）结直肠癌的临床试验（KEYNOTE-016）结果显示，在接受Pembrolizumab治疗后，dMMR结直肠癌患者与pMMR结直肠癌患者相比，肿瘤标志物水平显著下降，影像学缓解率高[12]。
图9. pMMR、dMMR 结直肠癌患者及dMMR 非结直肠癌患者在接受Pembrolizumab治疗后，肿瘤标志物及影像学缓解情况
3. 其他生物标志物
肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden， TMB）是另外一个与肿瘤免疫治疗客观反应率密切相关的标志物，抗PD-1/PD-L1治疗在27中肿瘤类型中的相关性研究发现MSI-H与TMB呈高度伴随表达[13]。
图10. TMB 与免疫治疗客观反应率
聚合酶ε（POLE）是一种参与DNA复制和修复的DNA聚合酶。 POLE突变（Mutations in Polymerase ε）可在结直肠癌中形成超突变，但其为微卫星稳定（MSS）表型 。
Gong等报告了一例难治性晚期结直肠癌患者使用Pembrolizumab进行治疗后获得临床疗效的个案。该患者经测定确认为MSS表型，NGS检测提示存在POLE突变。
在肿瘤免疫组化染色中，存在大量的CD8阳性肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），其中大于90％的TILs表达PD-1。在肿瘤微环境中的非肿瘤细胞上发现PD-L1表达超过99％，接近于PD-1+CD8-TILs，提示携带POLE突变的晚期结直肠癌，是可以预测对抗PD-1疗法反应的超突变表型[14，15]。
总之，结直肠癌基因表型及免疫表型都很复杂，目前PD-L1 免疫组化及MSI检测仍为免疫治疗相关重要的生物标志物，其它生物标志物的应用价值仍需将来大样本的临床实验加以验证。
参考文献
1. Lawrence MS， Stojanov P， Polak P， et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 2013， 499: 214-218.
2. Liu Y， Sethi NS， Hinoue T， et al. Schneider BG， Comparative Molecular Analysis of Gastrointestinal Adenocarcinomas. Cancer Cell. 2018， 33:721-735.
3. Guinney J， Dienstmann R， Wang X， et al. The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nat Med. 2015， 21:1350-1356.
4. Thorsson V， Gibbs DL， Brown SD， et al. The Immune Landscape of Cancer. Immunity. 2018， 48: 812-830.
5. Presented By Kurt Schalper at 2017 ASCO Annual Meeting.
6. Presented By Zev A. Wainberg， et al at ESMO 2017.
7. Gelsomino F， Barbolini M， Spallanzani A， et al. The evolving role of microsatellite instability in colorectal cancer: A review. Cancer Treat Rev. 2016 51:19-26.
8. Sinicrope FA， Sargent DJ. Molecular pathways: microsatellite instability in colorectal cancer: prognostic， predictive， and therapeutic implications. Clin Cancer Res. 2012， 18:1506-1512.
9. Ribic CM， Sargent DJ， Moore MJ， Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2003，349: 247-257.
10. Hutchins G1， Southward K， Handley K， et al. Value of mismatch repair， KRAS， and BRAF mutations in predicting recurrence and benefits from chemotherapy in colorectal cancer.J Clin Oncol..2011， 29:1261-1270.
11. Xiao Y， Freeman GJ. The microsatellite instable subset of colorectal cancer is a particularly good candidate for checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Discov. 2015 Jan;5(1):16-18.
12. Le DT， Uram JN， Wang H.et al. PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency.N Engl J Med. 2015，372:2509-2520.
13. Yarchoan M， Hopkins A， Jaffee EM. Tumor Mutational Burden and Response Rate to PD-1 Inhibition. N Engl J Med. 2017 Dec 21;377(25):2500-2501.
14. Gong J， Wang C， Lee PP， et al. Response to PD-1 Blockade in Microsatellite Stable Metastatic Colorectal Cancer Harboring a POLE Mutation. J Natl Compr Canc Netw. 2017， 15: 142-147.
15. Knijnenburg TA， Wang L， Zimmermann MT， et al. Genomic and Molecular Landscape of DNA Damage Repair Deficiency across The Cancer Genome Atlas. Cell Rep. 2018， 23: 239-254.
专家简介
李忠武
副教授 副主任医师 硕士研究生导师
北京大学肿瘤医院病理科 副主任
肿瘤学年鉴（Annals of Oncology）消化道肿瘤中文版编委；
世界华人消化杂志编委；
中国肿瘤临床杂志审稿人；
中华医学会病理学消化疾病学组委员；
中国医疗保健国际交流促进会神经内分泌肿瘤分会委员；
中国抗癌协会胰腺癌专业委员会神经内分泌肿瘤学组委员；
CSCO 黑色素瘤专业青年委员会副主任委员
重点从事胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤病理诊断及其分子机制研究。2015年10月-2016年10月，美国加州大学旧金山分校（UCSF）访问学者。2010年，入选北京市科技新星计划，并获得该计划B类基金资助。另外，还获得北京市科委首都特色临床应用研究、首都卫生发展科研专项基金、人社部留学归国人员择优资助等项目。共发表SCI文章40多篇，其中以第一作者及通讯作者发表SCI文章18篇。
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