干货分享：教你做real-time PCR第二话

大家好，阳光明媚，今天我们来走进一个新的系列，最全基本实验学习系列，今天，我们主要来学习real-time PCR的基础知识和操作方法。

1real-time PCR的基本原理师兄师兄，我从来没有做过定量PCR，到底怎么做啊！！！师姐师姐，定量PCR的数据如何分析啊，老板明天就要data了！！！！！！小伙伴们，大家别着急，首先让我们了解real-time PCR的基本原理，问一个最最基础的问题，我们为什么要做定量PCR？小伙伴肯定要说啊，我要干什么，干什么，干什么！对，你要用荧光定量PCR干什么？当你开展一项实验的时候，首先问自己，你用这个实验手段，是否能够真正的如实的证明你的猜想，或者回答你的问题。(这是当然，其实很多时候，我们往往忘了最初要证明或者回答的问题，而造成徒劳无功)回到我们real time PCR上来，我们real time PCR可以干什么？Real-time主要是相对定量DNA、RNA、microRNA等数量，比如我们可以使用real time PCR手段衡量一个细胞中某个基因mRNA水平表达量的变化差异等。

那么是如何实现可以定量DNA等的量那？如果说我们有100份DNA分子，然后通过30轮PCR，然后我们以最终30轮PCR产物的量和推测最初是不是100份，这样去衡量是否靠谱那？显然，这样是不靠谱的，因为我们PCR过程，极小的差别，比如不同的引物结合强度等最终对产物物质的量影响很大。比如下图：同样扩增96个样品，使用相同的条件，最终结果产生很大的差异。那么是否存在一个值非常具有重现性，与最初的物质的量成线性关系那？Ct值，Ct值是指扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。对于一般的扩增，主要分为四个步骤，首先是基线期，然后是指数增长期，线性生长期，平台期。首先我们来看基线期，在基线期，主要是由于误差引起的改变，但是如果我们使用标准偏差的十倍的阈值去卡的话，那么我们就可以准确的说捕捉到了PCR扩增，也就是大家平时所说起峰开始，这个时候，对于的循环数也就是ct值。