一种多信号比率型区分检测H2O2和H2S的荧光探针的设计、合成及应用的制作方法

本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种多信号比率型区分检测h2o2和h2s的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测h2o2和h2s方面的应用。

背景技术：

h2o2是其他活性氧的前体分子，在宿主防御，免疫应答和细胞信号传导中起着重要的作用。作为氧化应激的标志物，越来越多的研究表明，体内h2o2浓度的增加会诱导细胞蛋白的氧化损伤，导致神经退行性疾病，心血管疾病，癌症和阿尔兹海默症等。h2s作为体内的一种信号传递分子，在神经调节，细胞凋亡，抗炎症，抗氧化和抑制胰岛素信号传导等生理过程中起着广泛而重要的作用。研究发现，h2s通过提高细胞内谷胱甘肽的水平、调节抗氧化蛋白的高表达等途径，来保护细胞免受氧化应激的损伤。h2s本身具有的还原性也会直接清除h2o2等活性氧物质。h2s和h2o2在生理过程中有如此重要的作用，同时彼此互相影响，开发一种有效的检测方法是至关重要的，特别是对细胞内h2s和h2o2的浓度的监测，对生物学研究和临床诊断至关重要。

目前对h2s和h2o2的检测方法主要有比色法、电化学分析法、气相色谱法、滴定法、分光光度法和荧光法等。在这些方法中，荧光探针成像技术由于操作简单，灵敏度高，选择性好，实时成像等优点，特别是对组织的非破坏性而受到特别的关注。近年来开发了大量的荧光探针来检测h2s和h2o2，但他们都是独立的对h2s或h2o2进行选择性检测，还没有一个探针分子可以同时区分检测h2s和h2o2。

技术实现要素：

本发明目的之一是提供一种合成路线简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，斯托克斯位移大，发射波长在近红外，能够对体外或者活细胞内进行监测或者细胞成像的荧光探针。比率型荧光信号通过两个荧光信号的比值作为输出信号，探针分子本身的自校准能够克服诸如探针浓度、仪器灵敏度和环境因素带来的影响，提高荧光检测的准确性。通过探针与h2s和h2o2反应后获得不同组合的荧光信号来实现对h2s和h2o2的区分检测。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种多信号比率型区分检测h2o2和h2s的荧光探针，其分子结构式如下：合成路线如下：

具体合成方法如下：将化合物(7-羟基-2-氧代-2h-色烯-4-基)甲基(e)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基)-1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于丙酮，置于圆底烧瓶中，加入碳酸钾60℃搅拌回流反应。tlc监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，剩余物用柱层析分离纯化，二氯甲烷/乙酸乙酯(v:v＝20:1,含1％三乙胺)作为洗脱剂。干燥得到红色固体

本发明的荧光探针测试方法如下，将探针分子溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制成1.0×10^-3mol/l的溶液，室温下进行测试。并且对低浓度的h2s和h2o2可以进行定量检测，具体实施方法在实施实例中详细介绍。

本发明的荧光探针的作用机理如下，在探针分子中，探针本身发蓝色荧光，且有两个反应位点。当探针与h2s反应时，位点1的叠氮基被还原，随后醚键被切断，经过快速的分子内成环反应得到发蓝色荧光的hcb和发红色荧光的tqc。当探针tcab与h2o2反应时，位点2的醚键被切断，释放出发蓝绿色荧光的化合物tca，探针的荧光发生了从蓝光到蓝绿色的比值变化。通过探针tcab与h2s和h2o2反应得到不同的荧光信号：h2s(蓝光+红光)，h2o2(蓝光→蓝绿光)，可以实现对h2s和h2o2的区分检测。随后，我们进一步研究了探针与两种响应物叠加响应的情况。当向探针tcab与h2s响应后的溶液中继续加入h2o2时，前一步的产物hcb上的苯硼酸酯会继续被h2o2切断，从而释放出蓝绿色的荧光染料hc，同时之前得到的红光染料tqc不受影响。同样的，向探针tcab与h2o2响应后的溶液中继续加入h2s时，tca上的叠氮基会继续被h2s还原，醚键断裂，再经过快速的分子内成环反应得到发蓝绿色荧光的染料hc和发红色荧光的染料tqc。由此可见，探针tcab可以实现对h2s和h2o2的连续检测。

探针分子的响应过程：

本发明的荧光探针探针tcab与h2s和h2o2的荧光响应测试在hepes缓冲液(20mm,1.0mmctab,ph＝7.4)中进行。探针本身在413nm处发蓝色荧光。当探针tcab的溶液中加入h2o2时，413nm处的荧光下降，同时在486nm处有新的蓝绿色荧光生成(激发波长为325nm)。荧光滴定实验结果显示，随着h2o2浓度的增大，486nm处的荧光强度(f486nm)与413nm处的荧光强度(f413nm)的比值显著增大，当h2o2浓度达到400μm时，f486nm/f413nm的值达到最大。并且f486nm/f413nm的值与h2o2的浓度在20-100μm范围内有很好的线性关系，线性相关系数为0.9968。另外，当探针tcab与h2s响应时，反应液在413nm处的蓝色荧光增强(激发波长为325nm)，同时在627nm处有新的红色荧光生成(激发波长为475nm)。随着h2s浓度的增加，反应体系在413nm和627nm处的荧光强度逐渐增强，在350μm的h2s加入时，荧光强度达到最大值。并且探针tcab在413nm和627nm处的荧光强度与h2s在浓度范围为0-150μm时具有很好的线性关系，线性相关系数分别为0.9905和0.9901。根据信噪比s/n＝3，计算出探针tcab对h2s和h2o2的检测限分别为0.058和0.044μm。随后，我们还测定了探针tcab与h2s和h2o2响应前后的紫外光谱变化情况

本发明所述的探针分子合成路线简单，成本较低，对h2s和h2o2的选择性好、抗干扰能力强，斯托克位移大，该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明荧光探针tcab(10.0μm)在hepes缓冲液(20mm,1.0mmctab,ph＝7.4)中与h2o2(400μm)和h2s(350μm)响应前后的紫外吸收光谱。

图2(a-b)探针tcab(10.0μm)与h2o2完全反应后的溶液随h2s浓度增加的荧光光谱变化。(c-d)探针tcab(10.0μm)与h2s完全反应后的溶液随h2o2浓度增加的荧光光谱变化。激发波长：第一列325nm；第二列475nm。激发和发射狭缝宽度为5nm/5nm。

图3为本发明的荧光探针tcab(10.0μm)在hepes缓冲液(20mm,1.0mmctab,ph＝7.4)中与h2o2(400μm)和h2s(350μm)响应时，f486nm/f413nm的比值以及413nm和627nm处的荧光强度随时间的变化。激发波长：(a)325nm,(b)325nm,(c)475nm。

图4为本发明的荧光探针tcab(10.0μm)在hepes缓冲液(20mm,1.0mmctab,ph＝7.4)中与相关分析物响应后，f486nm/f413nm的比值以及413nm和627nm处的荧光强度变化。分析物包括：(1)roo^.,(2)no^.,(3)clo^-,(4)o2^-,(5)tbhp,(6)tbo^.,(7)onoo^-,(8)¹o2,(9)oh^-,(10)so4^2-,(11)no3^-,(12)scn^-,(13)cl^-,(14)co3^2-,(15)so3^2-,(16)n3^-,(17)aco^-,(18)na⁺,(19)mg²⁺,(20)ca²⁺,(21)k⁺,(22)fe³⁺,(23)cys,(24)gsh,(25)h2o2,(26)h2s。浓度：(1)-(25)400μm,(26)350μm，激发波长：(a)325nm,(b)325nm,(c)475nm。

图5为高效液相色谱：(a)探针tcab(50.0μm)；(b,c,d)探针tcab(50.0μm)分别与10.0,20.0和40.0equiv.的h2o2在hepes缓冲液(20mm,1.0mmctab,ph＝7.4)中响应120分钟；(e)化合物tca(50.0μm).流动相：h2o/ch3cn(v/v,2/8)；流速：0.5ml/min；温度：25℃；检测波长：350nm。

图6高效液相色谱：(a)探针tcab(50.0μm)；(b,c,d)探针tcab(50.0μm)分别与10.0,20.0和40.0equiv.的h2s在hepes缓冲液(20mm,1.0mmctab,ph＝7.4)中响应80分钟；(e)化合物tqc(50.0μm)；(f)化合物hcb(50.0μm).流动相：h2o/ch3cn(v/v,2/8)；流速：0.5ml/min；温度：25℃；检测波长：350nm。

图7为本发明的荧光探针tcab(10.0μm)在不同ph环境下与h2s和h2o2的响应情况。荧光强度：(a)f486nm/f413nm,(b)413nm,(c)627nm；激发波长：(a)325nm,(b)325nm,(c)475nm。

图8不同浓度的探针tcab对hela细胞毒性的分析。

图9探针tcab在hela细胞内对外源性h2o2和h2s的共聚焦荧光成像。(a)细胞先与500μmh2o2孵育30分钟，再与10μm探针tcab孵育30分钟。(b)细胞先与500μmh2s孵育30分钟，再与10μm探针tcab孵育30分钟。(c)细胞先与10μm探针tcab孵育30分钟，再与500μmh2o2孵育30分钟，最后与500μmh2s孵育30分钟。(d)细胞与10μm探针tcab孵育30分钟。第一列：蓝光通道，激发波长405nm，收集范围420-450nm；第二列：蓝绿光通道，激发波长405nm，收集范围460-510nm；第三列：红光通道，激发波长488nm，收集范围600-650nm；第四列：合并蓝光，蓝绿光和红光通道。

具体实施实例

本发明的探针分子结构式如下：

本发明的探针合成路线如下所示；

实施例1：探针的合成；

英文名称：

(2-oxo-7-((4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)benzyl)oxy)-2h-chromen-4-yl)methyl(e)-3-(7-((4-azidobenzyl)oxy)-1,4-diethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-6-yl)-2-cyanoacrylate

中文名称：(2-氧代-7-((4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊烷-2-基)苄基)氧基)-2h-色烯-4-基)甲基(e)-3-(7-((4-叠氮苯甲酰)氧基)-1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯

结构式：

合成方法：将化合物tca(60mg,0.1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(60mg,0.2mmol)溶于10ml丙酮，置于25ml圆底烧瓶中，加入碳酸钾(28mg,0.2mmol)，60℃搅拌回流反应3h。tlc监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，剩余物用柱层析分离纯化，二氯甲烷/乙酸乙酯(v:v＝20:1,含1％三乙胺)作为洗脱剂。干燥得到红色固体35mg，产率为43％。表征数据：hrms(esi)m/z:[m]calcdforc46h47bn6o8,822.3548；found,822.3605.¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(s,1h),7.76(s,1h),7.49(d,j＝8.8hz,1h),7.45–7.39(m,4h),7.37(d,j＝7.8hz,2h),7.03(d,j＝8.4hz,2h),6.94(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),6.89(d,j＝2.3hz,1h),6.42(s,1h),5.99(s,1h),5.41(s,2h),5.12(d,j＝23.9hz,4h),3.56(s,2h),3.36(d,j＝6.2hz,4h),3.21(s,2h),1.35(t,12h),1.26(q,j＝3.2hz,6h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ164.6,161.8,160.8,156.7,155.5,149.2,147.8,144.4,144.0,140.0,138.8,135.1,133.3,128.7,126.6,126.1,124.7,119.4,118.4,113.2,111.0,110.4,109.9,102.4,94.2,83.9,70.8,70.4,65.3,61.9,53.4,48.0,45.4,29.7,24.9,10.9,9.8.

实施例2：细胞培养和荧光成像；

hela细胞(人宫颈癌细胞)来源于湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室。hela细胞培养在含10％的胎牛血清和1％的盘尼西林的dmem培养液中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养24h。然后接种到激光共聚焦培养皿中，继续孵育12h，待细胞贴壁后可进行荧光成像实验。

外源性h2s和h2o2的检测。实验组一和二：首先移除培养基，pbs缓冲液漂洗细胞三次，向培养皿中加入500μm的na2s或h2o2，细胞在37℃和5％二氧化碳条件下培养30分钟，然后用pbs缓冲液漂洗细胞三次，将探针tcab(10μm)加入到培养皿中，与细胞孵育30分钟，pbs漂洗后进行荧光成像；实验组三：移除培养基，pbs缓冲液漂洗细胞三次，将探针tcab(10μm)加入到培养皿中，与细胞孵育30分钟，pbs缓冲液漂洗细胞三次，然后向培养皿中加入500μm的na2s，与细胞孵育30分钟，用pbs缓冲液漂洗细胞三次，然后向培养皿中加入500μm的h2o2，继续与细胞孵育30分钟，pbs漂洗后进行荧光成像。对照组：移除培养基，pbs缓冲液漂洗细胞三次，将探针tcab(10μm)加入到培养皿中，在37℃和5％二氧化碳条件下与细胞孵育30分钟，pbs漂洗后进行荧光成像。

内源性h2s和h2o2的检测。实验组一：移除培养基，pbs缓冲液漂洗细胞三次，向培养皿中加入佛波酯(pma,1μg/ml)，细胞孵育30分钟后用pbs缓冲液漂洗三次，将探针tcab(10μm)加入到培养皿中，与细胞孵育30分钟，pbs漂洗后进行荧光成像；实验组二：移除培养基，pbs缓冲液漂洗细胞三次，向培养皿中加入硝普钠(snp,100μm)，细胞孵育30分钟后用pbs缓冲液漂洗三次，将探针tcab(10μm)加入到培养皿中，与细胞孵育30分钟，pbs漂洗后进行荧光成像；对照组：移除培养基，pbs缓冲液漂洗细胞三次，将探针tcab(10μm)加入到培养皿中，在37℃和5％二氧化碳条件下与细胞孵育30分钟，pbs漂洗后进行荧光成像。