注射用胶原酶应用于SVF的制备及SVF的制备方法与流程

本发明涉及胶原酶应用领域，特别是指一种注射用胶原酶应用于svf的制备及svf的制备方法。

背景技术：

目前，脂肪组织因其在能量调控、炎症反应和免疫应答方面的作用已被认为是一个内分泌器官。此外，它还是具有多向分化潜能的多功能细胞的来源之一，而这种多功能细胞就存在于脂肪组织的血管基质部分中。脂肪组织中的血管基质片段(svf)是脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到的。正因为svf易于从脂肪组织中提取并含有丰富的、可塑性极强的脂肪组织来源的间充质干细胞(adiposetissue-derivedmesenchymalstemcells，asc),所以对svf的提取和制备是有必要进行研究的。svf代表一组异质性的细胞群，在脂肪组织中它们围绕在脂肪细胞的周围，其功能包括：1)体内参与血管生成2)多功能干细胞的储存库，在脂肪、骨以及软骨的重建中具有重要作用3)内分泌功能：具有能量调控、炎症反应以及免疫应答功能。

svf的细胞组分主要包括以下几种：

(1)内皮组细胞：cd45-/cd31+/cd34+/cd133+

(2)内皮细胞：cd31+/cd34-/cd133-

(3)周细胞：cd146+/cd45-/cd31-

(4)sa-asc(脂肪前体细胞)：cd34+/pdgfrα+/cd45-/cd31-

(5)造血干细胞：cd45+/cd31-/cd146-/cd34-/cd206+/cd14-

(6)adsc：cd45-/cd31-/cd44+/cd90+/cd73+/cd36+/cd106-

(7)单核细胞：cd14+/cd16+

(8)i巨噬细胞：cd14+/cd45+/cd206-/cd86+

ii巨噬细胞：cd14+/cd45+/cd206+/cd163+/cd68+

在临床多个领域都有巨大的潜在应用空间，国内外均有大量相关的基础及临床实验研究，目前干细胞治疗在整形外科、心脏科、血管外科、烧伤科、消化科、血液科、风湿免疫科等领域都有相关临床应用开展。但是，对于svf的提取和制备就现有技术而言，还存在以下不足：实验室所用胶原酶属于生物制剂不能应用于人体。胶原酶在svf提取物中的残留量能否达到人体安全可接受的范围亦不明确。

技术实现要素：

本发明提出一种注射用胶原酶应用于svf的制备及svf的制备方法，解决了现有技术中实验室用胶原酶无法应用于人体的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

注射用胶原酶应用于svf的制备。

进一步的，所述的注射用胶原酶为用于治疗椎间盘突出髓核的制剂。在一些实施例中，所述注射用胶原酶制成用于消化的胶原酶溶液，具体过程为：在600单位注射用胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即得。

一种svf的制备方法，包括：

(1)用生理盐水漂洗人体脂肪，去除手术中脂肪的其他药物成分，静置或离心得到漂洗后的人体脂肪；

(2)将上述漂洗后的人体脂肪置于容器中，在所述容器中加入胶原酶原液及生理盐水；

(3)将所述容器置于摇床中，37℃温度下消化20-120分钟，所述摇床的振荡频率为每分钟150-400rpm；

(4)将步骤(3)摇床培养后的容器离心5-15分钟，离心力为500-2000g，在无菌环境下去除上层黄色油脂层，在下层中加入生理盐水重悬，过滤，去除滤液，滤渣备用；

(5)将所述滤渣离心洗涤，离心力为300-1500g，每次3-5分钟，下沉细胞团即为svf。

在一些实施例中，所述步骤(2)中按照每1ml脂肪，加入上述配制好的胶原酶溶液0.05-0.3ml，随后加入生理盐水至总体积为脂肪的2倍。

在一些实施例中，所述步骤(5)离心洗涤2次。

在一些实施例中，所述步骤(5)的过滤采用40-100μm单细胞滤网。

有益效果

(1)本发明将注射用胶原酶应用于svf的制备中，提供了注射用胶原酶的新用途；该注射用胶原酶为已批准的可以用于人体的药剂，无任何其他化学添加。

(2)本发明制备svf的方法中注射用胶原酶用量较低，制备得到的svf中胶原酶含量<0.001u/ml，经常检测不到，较国外已上市的自动化svf制备机器的残余浓度均低，同时本发明方法制备得到的svf在细胞数量和增殖活性上也较常规方法制得的svf无明显差异。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：实施例1制得的svf与其他方法得到的svf的生长曲线图。

图2：实施例1制得的svf的细胞增殖情况。

图3：采用现有方法制得的svf的细胞增殖情况。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

注射用胶原酶(上海乔源)应用于svf的制备。

将注射用胶原酶制成用于消化的胶原酶溶液，具体过程为：在600单位注射用胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即得。

将上述注射用胶原酶用于制备svf中，具备的制备方法，包括：

(1)将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除液体，用生理盐水漂洗脂肪2次后，去除手术中的利多卡因肾上腺素等药物成分。

(2)取10ml洗涤后的脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入1ml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。

(3)将步骤(2)的无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中。具体参数可选择37℃温度下消化20-120分钟，恒温摇床的振荡频率每分钟150-400rpm。本实施例中为消化30分钟，振荡频率200rpm。

(4)将经过步骤(3)的无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为1500g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入生理盐水重悬，并通过70μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；

(5)将步骤(4)中的滤渣离心洗涤1-3次，离心力为500g，每次3-5分钟，下沉细胞团即为svf。制备得到的svf中胶原酶含量<0.001u/ml。

实施例2

注射用胶原酶(上海乔源)应用于svf的制备中。

将注射用胶原酶制成用于消化的胶原酶溶液，具体过程为：在600单位注射用胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即得。

将上述注射用胶原酶用于制备svf中，具备的制备方法，包括：

(1)将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除液体，用生理盐水漂洗脂肪2次后，去除手术中的利多卡因肾上腺素等药物成分。

(2)取10ml洗涤后的脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入3ml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。

(3)将步骤(2)的无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中。具体参数可选择37℃温度下消化20分钟，恒温摇床的振荡频率每分钟400rpm。本实施例中为消化20分钟，振荡频率400rpm。

(4)将经过步骤(3)的无菌离心管放入离心机中离心15分钟，离心力为500g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入生理盐水重悬，并通过40μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；

(5)将步骤(4)中的滤渣离心洗涤2次，离心力为300g，每次3-5分钟，下沉细胞团即为svf。制备得到的svf中胶原酶含量<0.001u/ml。

实施例3

注射用胶原酶(上海乔源)应用于svf的制备中。

将注射用胶原酶制成用于消化的胶原酶溶液，具体过程为：在600单位注射用胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即得。

将上述注射用胶原酶用于制备svf中，具备的制备方法，包括：

(1)将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除液体，用生理盐水漂洗脂肪2次后，去除手术中的利多卡因肾上腺素等药物成分。

(2)取10ml洗涤后的脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入0.5ml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。

(3)将步骤(2)的无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中。具体参数可选择37℃温度下消化20-120分钟，恒温摇床的振荡频率每分钟150-400rpm。本实施例中为消化120分钟，振荡频率150rpm。

(4)将经过步骤(3)的无菌离心管放入离心机中离心5分钟，离心力为2000g，在无菌环境下去除上层黄色油脂层，在下层中加入生理盐水重悬，并通过100μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；

(5)将步骤(4)中的滤渣离心洗涤1-3次，离心力为1500g，每次3-5分钟，下沉细胞团即为svf。制备得到的svf中胶原酶含量<0.001u/ml。

对比例1

实验室用胶原酶collagenesenb4(sigma)应用于svf的制备中

将实验室用胶原酶制成用于消化的胶原酶溶液，具体过程为：在40mg实验室用胶原酶中加入50ml生理盐水，充分混合，即得。

将上述实验室用胶原酶用于制备svf中，具备的制备方法，包括：

(1)将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除液体，用生理盐水漂洗脂肪2次后，去除手术中的利多卡因肾上腺素等药物成分。

(2)取10ml洗涤后的脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入上述已配置好的实验室胶原酶10ml。

(3)将步骤(2)的无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中。具体参数可选择37℃温度下消化30分钟，恒温摇床的振荡频率每分钟200rpm。本实施例中为消化30分钟，振荡频率200rpm。

(4)将经过步骤(3)的无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为1500g，在无菌环境下去除上层黄色油脂层，在下层中加入生理盐水重悬，并通过40μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；

(5)将步骤(4)中的滤渣离心洗涤2次，离心力为700g，每次3-5分钟，下沉细胞团即为svf。

本发明方法制得的svf与现有方法制得的svf(对比例1)试验对比如下：

1.胶原酶残留的检测：

文献中常用的胶原酶的消化脂肪的消化浓度是0.075-0.2％。

本发明中胶原酶消化浓度为0.0015％-0.015％，低于常用胶原酶的消化浓度，在获得的svf中胶原酶残留量非常低，可忽略不计。

2.胶原酶用量的比较:

20ml脂肪，本发明方法采用已上市的注射用胶原酶，而常规方法采用24mg胶原酶(实验试剂)，最后制得的svf的量无明显差异，分别为：2.64±0.06×10⁷(n＝5)和2.63±0.04×10⁷(n＝5)p>0.05。

3.采用cck8法测试不同方法制备的svf的细胞活性，结果如图1所示，图1中a为本发明方法制得的svf，b为现有方法制得的svf，由此可见，本发明方法制得的svf的细胞活性较现有方法无明显差异。

4.不同方法制备的svfp0培养7天(40×)，其中图2是本发明方法制得的svf，图3是现有方法制得的svf(对比例1)，通过比较可以看到本发明方法制得的svf的增殖活性较现有方法无明显差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。