细胞大规模瞬时转染方法与流程

本发明涉及细胞大规模瞬时转染方法，用于重组蛋白的大规模生产。
背景技术：
：重组蛋白特别是以单克隆抗体蛋白为代表的治疗用蛋白主要是在哺乳动物细胞中进行表达生产。而被最广泛运用的是cho细胞(chinesehamsterovarycell，中国仓鼠卵巢细胞)，其被广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。在哺乳动物细胞里进行转染主要有两种方式：瞬时转染和稳定转染。稳定转染用于建立克隆的细胞系，这种细胞系中转染的目的基因整合到染色体dna中并指导适量目的蛋白的合成。稳定转染可获得持续较长时间的高效稳定的表达，而且产率很高。但是，蛋白的稳定表达需要构建稳定表达的工程细胞株，这个过程需要6-12个月的时间，耗费的成本巨大；有毒性的蛋白也无法通过稳定细胞株进行表达生产；另外蛋白基因在细胞株里的稳定表达也是一个很大的挑战，由于基因沉默或者拷贝数的丢失，往往造成不稳定的蛋白表达。瞬时转染的质粒dna进入细胞后不需要稳定整合进宿主细胞的基因组，以游离状态表达外源基因。瞬时转染的周期短，能够快速获得目的蛋白，能够应用于研发起始阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。然而，常用的细胞瞬时转染方法的转染效率较低，且转染后细胞中目的基因的表达产量较低，不能满足实际需求。技术实现要素：本发明涉及一种运用哺乳动物细胞(尤其是cho细胞)进行重组蛋白的大规模生产方法，特别是，一种运用哺乳动物细胞(尤其是cho细胞)进行重组蛋白的大规模瞬时转染的生产方法。本发明工艺可放大，瞬转规模达到了单次反应200l，此外，还具有生产周期短，蛋白表达量高，产量高，生产成本低等优点。本发明提供了一种哺乳动物细胞瞬时转染进行重组蛋白生产的方法，所述方法包括如下步骤：摇瓶培养哺乳动物细胞悬液；生物反应器扩增所述哺乳动物细胞悬液；反应罐扩增所述生物反应器中的哺乳动物细胞悬液；向所述反应罐哺乳动物细胞悬液中加入质粒和转染试剂进行瞬时转染；培养所述经转染的哺乳动物细胞。在一些实施例中，上述生物反应器为wave生物反应器。在一些实施例中，上述哺乳动物细胞为cho细胞。在一些实施方案中，上述cho细胞为cho18细胞。在一些实施例中，上述cho细胞培养所用的培养基为cdcho或dynamis培养基。在一些实施例中，上述cho细胞培养所用的培养基为cdcho培养基。在一些实施例中，在摇瓶培养前，要先将冻存的细胞复苏。在一些实施例中，上述摇瓶培养是于约3％-10％的co2浓度、约35-38℃和约100-140rpm转速进行培养；优选地，是于约6％-8％的co2浓度、约36-37℃和约110-130rpm转速进行培养。在一些实施例中，上述摇瓶培养包括使用体积25ml-1l，优选50ml-500ml，更优选125ml或250ml的摇瓶进行培养。在一些实施例中，上述摇瓶培养还包括使用体积为1-10l、优选约2-8l、优选约4-6l、优选约1l、3l或5l的摇瓶进行培养。在一些实施例中，上述摇瓶培养进行2次或2次以上，当培养的细胞密度为约(2.0～6.0)×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％时，更换摇瓶进行摇瓶扩增。在一些实施例中，上述摇瓶培养通过2次或2次以上逐级扩增至5l-10l摇瓶，优选5l摇瓶。在一些实施例中，上述每次摇瓶培养的细胞接种密度为0.2×106-0.6×106个细胞/ml。在一些实施例中，上述摇瓶培养在35-38℃、100-140rpm、3-10％co2浓度的条件下进行，优选在36-37℃、110-130rpm和6-8％co2浓度的条件下进行。在一些实施例中，使用细胞密度为约2.0×106～6.0×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％的摇瓶培养物进行生物反应器扩增。在一些实施例中，生物反应器扩增时，接种密度为0.2×106-0.6×106个细胞/ml。在一些实施例中，上述生物反应器的参数为：温度约35-37℃，co2浓度约0-5％，通气流量0.2-0.6lpm，角度约6-8°；优选地，所述温度为约35.5-36.5℃。在一些实施例中，上述生物反应器的体积为约10-100l，优选约20-80l，优选约40-60l，优选约50l。在一些实施例中，使用细胞密度为约2.0×106～6.0×106个细胞/ml，细胞活率≥90.0％的培养物进行反应罐扩增。在一些实施例中，上述反应罐的参数为：温度约35.5-36.5℃，ph约6.7-7.3，转速约50～100rpm，溶氧(do)约30-50％；优选地，温度约36.0℃，ph约7.0，转速约60rpm，溶氧约40％；更优选地，深层空气约1.0lpm，表层空气约1.0lpm。在一些实施例中，生物反应器获得的细胞以(0.7-1.1)×106个细胞/ml的接种密度接种到反应罐中。在一些实施例中，上述反应罐体积为约100l-500l，优选约200-400l，优选为约200l。在一些实施例中，当反应罐中细胞密度为约3.0×106～5.0×106个细胞/ml时，进行瞬时转染。在一些实施例中，上述质粒浓度不低于0.5μg/μl。在一些实施例中，上述转染试剂为聚乙烯亚胺(pei)，所述pei的浓度为约1-3mg/ml。在一些实施例中，在所述瞬时转染前，先将质粒加入到上述细胞的培养基中混匀，获得质粒混合物，然后将转染试剂加入上述质粒混合物中，加入时间为约0.5～2.0分钟，继续混合约1.0-2.0分钟后将所得转染混合物打入反应罐中；优选地，上述转染混合物加入的时间不超过15分钟。在一些实施例中，转染后第2、4、6和8天进行补料。在一些实施例中，在转染后，如果反应罐内培养液的糖含量低于2g/l时，补加浓度约为2-3g/l的葡萄糖至培养液中，使培养液中的糖含量≥2g/l。在一些实施例中，在转染后6-10天，结束瞬转表达过程。在一些实施例中，所述重组蛋白为单克隆抗体，优选为全人源抗2019-ncov单克隆抗体。附图说明图1：200l瞬转生产工艺流程图。图2：瞬转过程示意图。图3：200l瞬转生产表达量图。图4：200l瞬转生产活细胞密度(vcd)图。图5：200l瞬转生产细胞活率(via)图。图6：200l瞬转生产残糖(gluc)图。图7：200l瞬转生产细胞直径(dia)图。图8：200l瞬转生产乳酸(lac)图。图9：dynamics和cdcho培养基对比表达量(titer)图。图10：dynamics和cdcho培养基对比活细胞密度(vcd)图。图11：dynamics和cdcho培养基对比活率(via)图。图12：瞬时转染质粒骨架图；上图为重链的质粒，下图为轻链的质粒。图3到图8中的200l20200224jm、200l20200306-1jm和20200306-2jm分别代表不同时间的生产批号。具体实施方式除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。术语“转染”在本文中用于指将核酸、蛋白质或其它大分子传递到目标细胞，使得核酸、蛋白质或其它大分子在所述细胞中得以表达或具有生物功能。术语“瞬时转染”或“瞬时表达”是将dna导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组dna导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的dna不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞，并对溶解产物中目的基因的表达进行检测。术语“稳定转染”是用于建立克隆的细胞系，这种细胞系中转染的目的基因整合到染色体dna中并指导适量目的蛋白的合成。术语“细胞”是指包括所有类型的真核和原核细胞。在优选实施例中，所述术语是指真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。优选的细胞是可悬浮生长的细胞，尤其是可悬浮生长的哺乳动物细胞。在某些示例性但非限制性实施例中，术语“细胞”意指cho细胞或其变异体，如可悬浮生长的cho18细胞。术语“细胞培养”或“培养”意指在人造体外环境中维持细胞。术语“补给、补料或补充培养基”是指将一定体积的新鲜细胞培养基加入到己存在于培养物中的培养基中，和/或用新培养基补充已存在于培养物中的培养基。术语“重组蛋白”是指由引入到宿主细胞中的核酸编码的蛋白质。所述宿主细胞表达所述核酸。术语“表达核酸”与“从由核酸编码的rna表达蛋白质”同义。如本文中所用的“蛋白质”广泛地是指聚合氨基酸，例如肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白等。术语“蛋白质产量”是指由培养的细胞表达的蛋白质的量，且可例如根据每升培养基所产生的蛋白质克数来测量。如果蛋白质不由细胞分泌，那么蛋白质可通过所属领域的技术人员用已知的方法从细胞内部分离。如果蛋白质由细胞分泌，那么蛋白质可通过所属领域的技术人员用己知的方法从培养基中分离。由细胞表达的蛋白质的量可易于由所属领域的技术人员测定。蛋白质可为重组蛋白。术语“细胞悬液”意指培养容器中大部分或所有细胞以悬浮形式存在、且培养容器中少数或没有细胞附着于容器表面或容器内的另一个表面的细胞培养物。优选地，“悬浮培养在培养容器中具有≥75％的细胞呈悬浮形式，不附着于培养容器之上或之中的表面。更优选地，“细胞悬液”在培养容器中具有≥85％的细胞呈悬浮形式，不附着于培养容器之上或之中的表面。甚至更优选的是“细胞悬液”在培养容器中具有≥95％的细胞呈悬浮形式，不附着于培养容器之上或之中的表面。术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于培育细胞或组织的营养性溶液。这些短语可互换使用。术语“载体”指能够运输其已连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可接合其它dna区段的环状双链dna。一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它dna区段可接合到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)当引入到宿主细胞中时可整合到宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地说是“表达载体”)。一般来说，用于重组dna技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“表达载体”可以互换地使用，这是由于质粒是最常用的载体形式。可适于本发明实践的载体修饰类型的非限制性实例包括(但不限于)修饰，如加入一或多种增强子、一或多种启动子、一或多种核糖体结合位点、一或多种复制起点等的修饰。在某些优选但非限制性的实施例中，且本发明的实践中所用的表达载体可包括一或多种经选择以改进感兴趣蛋白质在本发明瞬时表达系统中的表达的增强子元件。所选增强子元件可位于用于表达感兴趣蛋白质的可表达的核酸序列的5’或3’。本发明中，感兴趣的蛋白质或采用本发明的cho细胞瞬时转染进行生产的蛋白质可以是在工农业和医疗卫生等领域中广泛使用具有感兴趣生物学功能的蛋白质，包括但不限于各种酶、抗体和生长激素等。感兴趣的酶可以是本领域周知的各种酶，包括但不限于合成酶、裂解酶、异构酶、磷脂酶、易位酶、氧化还原酶等等。感兴趣的抗体可以是本领域周知的各种抗体，包括但不限于治疗性抗体和检测用的抗体。抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单链抗体。多种技术和试剂可用于将大分子在称为“转染”的过程中引入到目标细胞中。常用试剂包括例如磷酸钙、deae葡聚糖以及脂质体。关于使用这些类型试剂的详细方案的实例可参见《当前分子生物学方案》(currentprotocolsinmolecμlarbiology，第9章，奥斯贝等人编，约翰威利父子公司(johnwileyandsons)，1998a)。转染细胞的其它方法在所属领域中是己知，且可包括电穿孔(基因电转移)、声孔作用、光学转染、原生质体融合、刺穿感染(impalefection)、磁性转染或病毒转导。“用于将大分子引入到细胞中的试剂”或“转染试剂”是指己知有助于大分子进入到细胞中的任何物质、调配物或组合物。在一些实施例中，试剂可为“转染试剂”且可为增加一或多种核酸摄取到一或多种目标细胞中的任何化合物和/或组合物。适合的转染试剂可包括(但不限于)一或多种化合物和/或组合物，其包含阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺(pei))、带正电荷氨基酸的聚合物(如聚赖氨酸和聚精氨酸)、带正电荷树枝状聚合物和断裂的树枝状聚合物、含有阳离子白环糊精的聚合物(cd聚合物)、deae-葡聚糖等。本发明提供一种大规模细胞瞬时转染法，该方法依次包括摇瓶培养、生物反应器扩增、反应罐扩增和对反应罐内的细胞进行瞬时转染的步骤。可选地，摇瓶培养前还包括细胞复苏步骤。本发明中，适用于本发明的细胞可以是本领域周知的各种用于瞬时转染的细胞，特别是真核细胞和原核细胞，优选哺乳动物细胞。优选的是，用于本发明的细胞是可悬浮生长的细胞，如可悬浮生长的哺乳动物细胞。在特别优选的实施方案中，采用本发明方法培养cho细胞，并对其进行瞬时转染。cho细胞可以是本领域常用的各种cho细胞，包括但不限于cho18细胞。本发明中，“扩增”指培养细胞，使细胞增殖，数量增长；“摇瓶扩增”指在摇瓶中培养较低密度的细胞，以获得较高密度的细胞，实现细胞数量的增长。本发明中，各阶段的细胞培养和扩增所用的培养基为本领域周知的适用于所培养的细胞的维持、培养和扩增的培养基。例如，当细胞是cho细胞时，合适的培养基包括但不限于dynamics培养基和cdcho培养基，优选cdcho培养基。应理解，各阶段的细胞培养基可以相同或不同，可根据实际培养情况加以确定。摇瓶培养前，可先将冻存的细胞复苏。可采用常规的方法复苏。例如，冻存的细胞在37℃左右解冻不超过2分钟，然后离心，获得沉淀，用预热的培养基重悬该细胞，使细胞复苏。在进行生物反应器扩增前，需要进行传代培养。通常在摇瓶中进行传代培养，此阶段也可称为摇瓶培养。摇瓶培养的次数可根据实际情况确定。当通过摇瓶培养使细胞数量扩增到足以进行生物反应器扩增的数量时，可停止摇瓶培养，使用合适的摇瓶培养物进行生物反应器扩增。通常，将复苏的细胞接入体积为25ml-5l、优选50ml-500ml、更优选125ml或250ml的摇瓶中，进行首次摇瓶培养/扩增。当细胞vcd达到(2.0～6.0)×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％时转入更大体积的摇瓶进行后续的摇瓶培养。用于后续的摇瓶扩增的摇瓶体积可为1l到10l，优选2-8l，优选4-6l，优选约5l。接种密度可根据不同细胞、不同摇瓶容积由本领域技术人员根据常规的培养方法确定。示例性的接种密度可为约0.2×106～0.6×106个细胞/ml培养基。各摇瓶的培养/扩增条件可设置为35-38℃、100-140rpm、3-10％co2浓度；优选为36-37℃、110-130rpm和6-8％co2浓度。摇瓶扩增可进行1次、2次、3次或3次以上。每次用于扩增的摇瓶的容积可相同，也可不同。例如，可将1l摇瓶培养获得的细胞转入数个2l摇瓶中进行扩增，也可直接可转入3l摇瓶中进行扩增。在优选的实施方案中，通过数次扩增至5l-10l摇瓶；更优选的实施方案中，摇瓶培养包括125ml摇瓶培养、1l摇瓶培养、3l摇瓶培养和5l摇瓶培养。应理解，当在5l摇瓶内进行扩增时，培养物的体积通常可在2-3l之间。每次摇瓶培养的细胞密度达到(2.0～6.0)×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％时可以更换摇瓶进行下一次的摇瓶扩增。当摇瓶扩增获得一定量的传代培养物(例如，能在生物反应器中实现0.2×106～0.6×106个细胞/ml培养基的接种密度)，使用细胞vcd为(2.0～6.0)×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％的摇瓶培养物进行生物反应器扩增。本发明中，生物反应器是使生物反应得以实现的装置，包括各种用于进行细胞培养和发酵的细胞培养装置。生物反应器的体积通常可为约10-100l，优选约20-80l，优选约40-60l，优选约50l。示例性的生物反应器包括但不限于wave生物反应器(sartoriusstedim，biostatrm)。示例性的接种密度可为约0.2×106～0.6×106个细胞/ml培养基。生物反应器中的反应条件可包括：温度约35-37℃，co2浓度约0-5％，通气流量0.2-0.6lpm，角度约6-8°；优选地，所述温度为约35.5-36.5℃。生物反应器的摇摆速度可为15-25rpm，优选18-22rpm。当生物反应器中细胞密度为约2.0×106～6.0×106个细胞/ml、优选4.0×106～6.0×106个细胞/ml，细胞活率≥90.0％时，进行反应罐扩增。本发明中，反应罐指用来进行细胞培养和发酵的细胞培养装置。示例性的反应罐包括来自sartoriusstedim(biostatstr)的反应罐。反应罐的体积可为约100l-500l，优选约200-400l，优选为约200l。反应罐扩增的接种密度可为0.7×106～1.1×106个细胞/ml培养基。反应罐的参数可设为：温度约35.5-36.5℃，ph约6.7-7.3，转速约50～100rpm，溶氧(do)约30-50％；优选地，温度约36.0℃，ph约7.0，转速约60rpm，溶氧约40％；更优选地，深层空气流速约1.0lpm，表层空气流速约1.0lpm。应理解，对于不同的细胞，其在摇瓶培养、生物反应器以及反应罐中的培养温度、转速、ph等相关工艺参数各有不同，这可由本领域技术人员根据实际反应条件选择最佳的工艺参数。本发明中，当反应罐中细胞密度为约3.0×106～5.0×106个细胞/ml时，进行瞬时转染。用于瞬时转染的载体可以是本领域熟知的各种载体，其含有感兴趣蛋白的编码序列。可根据所选用的细胞来选择合适的骨架载体，并采用常规的方法将感兴趣蛋白的编码序列以及相关的调控原件如启动子、增强子、复制起点以及任选的一个或多个标记克隆到骨架载体内，构建待转染的载体。感兴趣的蛋白如本文所述，优选为单克隆抗体，更优选为全人源单克隆抗体。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白为全人源抗2019-ncov单克隆抗体。转染时，可先混合细胞培养基和载体，混匀后再与转染试剂混合。通常，以不低于0.5μg/μl的浓度将载体与培养基混合。可将转染试剂加到细胞培养基和载体的混合物中，加入时间控制在约0.5～2.0分钟，然后混合上述三者的混合物约1.0-2.0分钟，之后将所得混合物加到反应罐中。优选地，混合物加入反应罐的时间不超过15分钟。转染试剂的浓度可根据转染试剂的种类、细胞的种类、载体的种类等确定，通常所配制得到的转染试剂的浓度为1-3mg/ml。在优选的实施方案中，转染试剂为聚乙烯亚胺(pei)。在优选的实施方案中，上述细胞为cho细胞，转染试剂为聚乙烯亚胺(pei)；在瞬时转染前，先将载体加到培养基中混匀，然后将转染试剂加入该载体和培养基的混合物中，加入时间为约0.5～2.0分钟，继续混合约1.0-2.0分钟后将所得混合物打入反应罐中，进行转染；优选地，上述转染混合物加入的时间不超过15分钟。转染后，进行补料培养。补料的时间可为转染后第2、4、6和8天。补充的物料可根据实际培养情况确定，以维持反应罐中的细胞正常生长并表达感兴趣的蛋白质为前提。例如，在一些实施例中，转染后如果反应罐内培养液的糖含量低于2g/l时，可补加浓度约为2-3g/l的葡萄糖，以使培养液中糖含量≥2g/l。通常，转染后6-10天，结束瞬转表达过程。此培养过程中的培养条件可设为：温度约35.5-36.5℃，ph约6.7-7.3、优选7.0±0.3，转速约50～100rpm，溶氧(do)约30-50％；优选地，温度约36.0℃，ph约7.0，转速约60rpm，溶氧约40％；更优选地，深层空气流速约1.0lpm，表层空气流速约1.0lpm。在本发明特别优选的实施方案中，本发明提供一种细胞、优选cho细胞瞬时转染方法，该方法包括：(1)细胞复苏；(2)摇瓶培养，其中，将复苏的细胞接入体积为50ml-500ml、优选125ml或250ml的摇瓶中，进行首次摇瓶培养；当细胞vcd达到(2.0～6.0)×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％时转入更大体积的摇瓶进行后续的摇瓶培养；其中，依次进行三次摇瓶扩增，体积扩增到5l摇瓶；其中，每次摇瓶培养的接种密度为0.2×106～0.6×106个细胞/ml培养基，每次摇瓶培养的条件为35-38℃、100-140rpm、3-10％co2浓度，优选为36-37℃、110-130rpm和6-8％co2浓度；其中，当最后一次摇瓶培养的培养物中细胞vcd达到(2.0～6.0)×106个细胞/ml、细胞活率≥90.0％时进行wave生物反应器扩增；(3)wave反应器扩增；其中，接种密度为0.2×106～0.6×106个细胞/ml培养基；生物反应器中的反应条件为：温度约35-37℃，co2浓度约0-5％，通气流量0.2-0.6lpm，角度约6-8°；优选地，所述温度为约35.5-36.5℃；生物反应器的摇摆速度可为15-25rpm，优选18-22rpm；当生物反应器中细胞密度为约2.0×106～6.0×106个细胞/ml、优选4.0×106～6.0×106个细胞/ml，细胞活率≥90.0％时，进行反应罐扩增；wave反应器的体积为约10-100l，优选约20-80l，优选约40-60l，优选约50l；(4)反应罐扩增；其中，反应罐扩增的接种密度为0.7×106～1.1×106个细胞/ml培养基，反应罐的参数可设为：温度约35.5-36.5℃，ph约6.7-7.3，转速约50～100rpm，溶氧(do)约30-50％；优选地，温度约36.0℃，ph约7.0，转速约60rpm，溶氧约40％；当反应罐中细胞密度为约3.0×106～5.0×106个细胞/ml时，进行瞬时转染；反应罐体积为约100l-500l，优选约200-400l，优选为约200l；和(6)瞬时转染；优选地，采用前文任一所述的瞬时转染方法进行瞬时转染。采用本发明的瞬时转染方法，在多次扩增细胞悬液后，把细胞培养体积扩大到约150l，加入转染试剂和含有目标dna的质粒混合物到细胞后，经过补料，调节ph水平和糖含量，在约8到12天的培养下，达到约300mg/l的单克隆抗体蛋白的表达水平。在一些实施方案中，本发明还提供一种细胞瞬时转染设备，包括：(1)反应罐；(2)与所述反应罐流体连通的密封搅拌容器；(3)与所述密封搅拌容器流体连通的储液容器。优选地，该细胞瞬时转染设备还包括驱动装置，包括驱动密封搅拌容器内的液体进入反应罐的驱动装置和驱动储液容器内的溶液进入密封搅拌容器的驱动装置。优选地，细胞瞬时转染设备还包括生物反应器以及连通所述生物反应器与所述密封搅拌容器的管路；任选地包括驱动所述生物反应器的内容物进入所述密封搅拌容器的驱动装置。通常，所述驱动装置为蠕动泵。优选地，所述储液容器和所述密封搅拌容器之间还设有过滤器，用于过滤从所述储液容器进入所述密封搅拌容器的液体。优选地，所述反应罐和生物反应器如前文所述。提供以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方案和方面，不应被解释为限制其范围。瞬转生产工艺流程见图1。实施例1：细胞复苏取30mlcdcho培养基(gibco,lifetechnologies)于125ml摇瓶中，将摇瓶放入二氧化碳摇床中预热15min以上。从液氮罐中取出一支cho18细胞(由cho-k1细胞改造而来)冻存管，放入37℃恒温水浴锅中解冻不超过2min。解冻后，用75％乙醇喷淋冻存管外壁，放入离心机，1000rpm，2min。去除冻存管中上清液，取少量已预热培养基重悬cho18细胞，然后转移到125ml摇瓶中。混合均匀后取细胞液0.5ml，用细胞活力分析仪(beckmancoμlter,vicellxr)测vcd(活细胞密度)，via(活率)和dia(细胞直径)。将摇瓶放入二氧化碳摇床中，参数设置：36.5±0.5℃、120±10rpm、7.0％±1.0％co2。培养第3-6天取样0.5ml，用细胞活力分析仪测vcd、via和dia。实施例2：摇瓶扩增当复苏的细胞vcd达到(2.0～6.0)×106个细胞/ml，细胞活率≥90.0％时可以扩增。细胞扩增后预计vcd为(0.2～0.6)×106个细胞/ml，计算所需培养基的量。取计算好体积的cdcho培养基转移到2l无菌摇瓶中，加入种子液，混合均匀，用细胞活力分析仪(beckmancoμlter,vicellxr)测vcd，via和dia。将摇瓶放入二氧化碳摇床中，参数设置：36.5±0.5℃、120±10rpm、7.0％±1.0％co2。取扩增后摇瓶种子液，用细胞活力分析仪测vcd，via和dia。培养第2-4天取样0.5ml，用细胞活力分析仪测vcd，via和dia。按照上面的方法将细胞再扩增两次，最终扩增到3个5l摇瓶中，2.5l/瓶。实施例3：wave生物反应器(sartoriusstedim，biostatrm)扩增3.1.当种子vcd达到(2.0～6.0)×106个细胞/ml，细胞活率≥90.0％时可以接种至wave生物反应器。3.2.按照wave接种后vcd为(0.2-0.6)×106个细胞/ml，计算wave接种所需的种子量，以及需补充的培养基的量，在超净台里将细胞转移至种子瓶中。3.3.用接管机(sartoriusstedim,biowelder)将种子瓶的出液管和wave培养袋接种管焊接上。3.4.通过蠕动泵将种子细胞接入培养袋中。3.5.接种完毕后，用封管机(sartoriusstedim，biosealer)封住wave培养袋的进液口，并检查封口处是否完全密封。3.6.开启wave生物反应器，开始培养，待wave生物反应器摆动5～10min后切换wave生物反应器至sampleposition模式后取样，用细胞活力分析仪测vcd和细胞活率，dia并镜检。3.7.继续培养2-4天后取样计数，当活细胞密度达到(4.0-6.0)×106个细胞/ml，细胞活率≥90％，进行下一步接种。wave生物反应器参数：摇摆速度18-22rpm摇摆角度6-8°通气流量0.2-0.6lpm温度36±0.5℃co2浓度0-5％实施例4：200l反应罐扩增(sartoriusstedim，biostatstr)4.1.当wave反应器中细胞密度达到(2-6)×106个细胞/ml，活率≥90％时进行接种。4.2.按照接种后细胞密度在(0.7-1.1)×106个细胞/ml，计算种子量和培养基用量。4.3.用接管机连接好wave反应器和200l反应罐管路，用蠕动泵将种子细胞由wave反应器接种到200l反应罐。4.4.接种后0.5～1hr，从200l反应罐取样口先取30ml样品弃去，再取样30ml样品，检测细胞密度、细胞活率和细胞直径。反应罐扩增示意图如图2所示。实施例5：瞬时转染5.1.200l反应器培养细胞44-52h后取样，用细胞活力分析仪进行细胞计数，当细胞密度达到(3.0-5.0)*106个细胞/ml时可以转染。转染前先将pei储液袋/瓶和50l无菌密封搅拌袋焊接在一起，然后将50l无菌密封搅拌袋和200l反应罐焊接在一起。5.2向一个50l配液搅拌袋中加入13.9-23.9kgcdcho培养基，然后将cb6(抗2019-ncov单克隆抗体)的重轻链质粒各165mg(质粒骨架见图12)加入上述培养基中，搅拌混匀后将质粒混合物无菌过滤到5.1中所述50l无菌密封搅拌袋中。5.3配制3mg/mlpei溶液(称取2310mgpei粉末，超纯水693g，混合搅拌至pei完全溶解后，调节ph至6.8-7.2，定容至770ml)，过滤除菌到上述pei储液袋/瓶中，待质粒混合物全部打入搅拌袋后，开始打入pei溶液，并计时，边打入pei溶液边搅拌，pei溶液打入的时间在30s-2min，混合物继续搅拌1-2min后打入200l反应罐中。5.4.通过无菌焊接机分别无菌焊接cellboost7a和cellboost7b(hyclone,gehealthcare)补料培养基到200l反应器，操作结束后检查管路是否有破损。转染后第2、4、6、8天添加前述培养基补料，cellboost7a添加量为转染体积(反应罐内全部液体体积)的3-6％，cellboost7b的添加量为转染体积的0.3-0.6％。5.5.转染后6-10天下罐，细胞活率高于70％。转染过程中，每24小时取样一次，取样时从取样口先取样30ml弃去，再取样30ml用于分析和留样。检测活细胞密度、活率、直径以及代谢参数。将检测剩余样品4000rpm离心5分钟后，于4℃冰箱保存，供培养结束后分析表达量或其它检测使用。根据工艺中ph控制范围7.0±0.3的设定，由设备自动添加酸碱调节。如果发酵液的残糖含量低于2g/l时补糖，补加2-3g/l葡萄糖的量。瞬转生产过程中，各指标检测如图3-8所示。经检测，蛋白的表达水平达到约300mg/l。200l反应罐参数：实施例6：dynamics培养基和cdcho培养基对比6.1细胞计数，将密度调整到3.5×106个细胞/ml，取两份27ml分别离心，1000rpm、3min，分别用dynamics和cdcho重悬，放入摇床培养，37℃，110rpm，7％co2。6.2分别取两份cdcho培养基，加入cb6质粒重轻链各30μg，0.22μm过滤器过滤后分别加入140μlpei溶液(3mg/ml)混匀后室温静置15min。6.3将上述混合液用移液管缓慢加入处理好的细胞中，边加边混匀。转染完成后放到摇床培养，37℃，110rpm，7％co2。培养中途取样监测细胞状态和表达量，见图9-11。结果表明，两种培养基均适用于cb6分子的瞬转，cdcho培养基在表达量(titer)，细胞活率(via)方面均优于dynamics培养基。当前第1页12