红参中化合物精氨酸双糖苷AFG的合成新方法

红参中化合物精氨酸双糖苷afg的合成新方法
技术领域：
1.本发明涉及一种以结晶分离技术为基础的分离、纯化精氨酸双糖苷 (arginyl-fructosyl-glucose，afg)的方法。具体涉及化合物精氨酸双糖苷(afg) 纯化的新方法，具体以氢氧化钡作为沉降剂纯化获得afg的新方法。


背景技术：

2.人参是中国传统名贵中药，它在《神农本草经》及《本草纲目》均有记载， 具有滋阴、益血、健胃、补气、强心等作用，被誉为“百草之王”，精氨酸双糖苷 (afg)是人参经热处理(加热或烘干)发生梅拉德反应后，由精氨酸与麦芽糖 脱水缩合、发生amadori重排而产生的
[1,2]
。郑毅男首次从红参中发现并鉴定其 结构，后研究发现其不是人参生长过程中的代谢产物，而是加工处理后的产物， 郑毅男
[3]
测定了生晒参与红参中的afg含量，分别为0.21％和4.91％，并对6年 生的生晒参进行煮沸处理1h后，afg含量由0.20％增加到0.59％。曹国军等
[4]
对不同蒸制时间、温度和不同烘干时间、温度对红参中afg含量影响进行了正 交试验，结果表明：在105℃下蒸制100min并于70℃下烘干14h红参中的afg 含量最高，其他条件的变化都会对afg的含量产生影响，人参中游离氨基酸约 占2％，而精氨酸含量高达50％
[5]
，麦芽糖占比约为2％，这为afg的合成提供 了先决条件；水分的增加会抑制afg的合成，而红参加工是一个不断干燥脱水 的过程，这为afg合成提供了环境条件。afg具有丰富药理活性，afg不仅可 以抗炎
[6]
、抗疲劳并增强免疫力，还具有抗氧化
[7]
、抗糖尿病
[8]
和抗衰老等
[9]
功效。
[0003]
目前，afg分离主要由阳离子交换树脂
[10]
与重复使用聚丙烯酰胺(bio-gel p
‑ⅱ
)凝胶
[11]
进行分离，但由于阳离子树脂会吸附一部分afg，洗脱过程中使用 的氨水味道较为刺激，对人体和环境有一定的危害，而单一使用聚丙烯酰胺 (bio-gel p
‑ⅱ
)凝胶进行分离无法达到较高纯度，若重复使用，则方法太为繁琐， 费时费力。


技术实现要素：

[0004]
本发明公开一种基于结晶原理的快速分离纯化利用化学合成的afg的方法，afg粗品通过申请人之前的专利申请202010520658.0得到，纯度约82.4％，作 为本发明进一步分离纯化的原料。
[0005]
本发明通过以下技术方案来实现：
[0006]
人参中特有化合物精氨酸双糖苷afg高效纯化方法，包括：
[0007]
将纯度为82.4％的粗品afg溶于少量水中，加入冷乙醇并调节乙醇占比， 加入一定量的氢氧化钡，在0～4℃环境中搅拌一段时间后，低温条件下结晶一段 时间后，析出杂质结晶，抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，目标产物afg存 在于所分离出的液体中，将上层清液低温冻干，即得。
[0008]
作为本发明的一种优选技术方案，将粗品afg溶于少量水中，加入冷乙醇 并调节乙醇与水的混合液乙醇占比为60～95％，优选90％，粗品afg与溶剂(乙 醇+水)的质量体积
fructosyl-glucose[j].j food sci, 2011,76(8):188.
[0028]
[9]孙荣花,郑毅男,邵莹,等.一种精氨酸双糖苷的合成方法及其在抗衰老中的应用[p]. 中国专利,cn104610384a,2015-05-13.
[0029]
[10]曹国军.人参加工条件与美拉德反应产物的相关性研究[d].吉林农业大学硕士学位论文, 1999.
[0030]
[11]郑毅男,松浦幸永,韩立坤,等.红参中新化合物
──
精氨酸衍生物的分离与结构鉴定[j]. 药学学报,1996(03):191-195.
具体实施方式：
[0031]
本发明和附图将通过以下方式实验来解释本发明，但本发明不局限于此。
[0032]
afg纯度检测方法
[0033]
1.1检测方法：运用柱前衍生高效液相色谱法进行检测纯化后干燥品中精氨 酸的残留量。
[0034]
1.2精氨酸标准品的制备：精密称取分析级精氨酸10.0mg，加色谱级甲醇定 容至10ml，即浓度为1mg/ml；备用。
[0035]
1.3每组分别精密称取10.0mg，按照氨基酸衍生法进行衍生检测。
[0036]
1.4色谱条件：venusil
‑‑
aa氨基酸分析专用柱(5μm，4.6mm
×
250mm)。 流动相a：乙酸钠缓冲溶液—乙腈溶液(ph＝6.5)；流动相b：乙腈水溶液v(乙 腈)：v(水)＝4:1。0min，0％b；4min，3％b；16min，10％b；17min，20％b； 32min，34％b；35min，70b％；42min，100％b；60min，0％b。流速1.0ml/min； 检测波长254nm；柱温40℃；进样量：20μl。
[0037]
1.5每组分别精密称取10.0mg，按照高效液相色谱-蒸发光散射检测方法进 行检测。
[0038]
1.6色谱条件：ultimate amino acid plus氨基酸分析专用柱(5μm，4.6 mm
×
300mm)，流动相a：0.5％的七氟丁酸水溶液，流动相b：乙腈。0min， 0％b，20min，15％b，30min，30％b，40min，0％b。漂移管温度110℃，气 体流量：3.2l/min；柱温25℃；进样量：20μl。
[0039]
以下试验用粗品afg的纯度为82.4％。
[0040]
实施例1：
[0041]
精确称取2gafg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入7.5ml冷乙 醇，使乙醇占比达到60％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅拌 15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后，抽 滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为88.5％，纯度为91.2％。
[0042]
实施例2：
[0043]
精确称取2gafg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入11.7ml冷 乙醇，使乙醇占比达到70％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为87.3％，纯度为93.8％。
[0044]
实施例3：
[0045]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入20.0ml冷 乙醇，使乙醇
占比达到80％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为86.8％，纯度为94.6％。
[0046]
实施例4：
[0047]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为86.2％，纯度为96.7％。
[0048]
实施例5：
[0049]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入95.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到95％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为80.1％，纯度为90.3％。
[0050]
表1.不同乙醇占比对影响afg纯化的统计表
[0051][0052]
由表1可知，当乙醇占比为90％时，afg纯度最高，得率也达到一个较高 水平。
[0053]
实施例6：
[0054]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入10mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为88.9％，纯度为90.8％。
[0055]
实施例7：
[0056]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入20mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为86.5％，纯度为92.4％。
[0057]
实施例8：
[0058]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入40mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为86.3％，纯度为93.2％。
[0059]
实施例9：
[0060]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入50mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为84.1％，纯度为89.7％。
[0061]
表2.不同氢氧化钡添加量影响afg纯化的统计表
[0062][0063]
由表2可知，同过控制变量法调控氢氧化钡与乙醇添加量，可以看出，当氢 氧化钡添加量为30mg时，得到afg纯度最高，可达到96.7％，得率达到86.2％。
[0064]
实施例10：
[0065]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶1h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为93.4％，纯度为80.3％。
[0066]
实施例11：
[0067]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶2h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为90.5％，纯度为85.6％。
[0068]
实施例12：
[0069]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶3h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为88.9％，纯度为89.3％。
[0070]
实施例13：
[0071]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶4h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为87.4％，纯度为93.7％。
[0072]
实施例14：
[0073]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇
占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶5h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为86.1％，纯度为96.5％。
[0074]
表3.不同低温结晶时间对影响afg纯化的统计表
[0075][0076]
由表3可知，当低温结晶时间过低时，结晶率较低，不能将杂质与液体充分 分离，当低温结晶时间过长时，资源消耗增加，故确定低温结晶时间为5-6h，afg得率为86.2％，纯度为96.7％。
[0077]
实施例15：
[0078]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-10℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为88.6％，纯度为91.0％。
[0079]
实施例16：
[0080]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-15℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为87.4％，纯度为93.5％。
[0081]
实施例17：
[0082]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-25℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为85.9％，纯度为94.7％。
[0083]
实施例18：
[0084]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钡，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-30℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 测得得率为85.8％，纯度为95.2％。
[0085]
表4.不同温度结晶对影响afg纯化的统计表
[0086][0087]
由表4可知，当结晶温度较高时，结晶率较低，不能将杂质与液体充分分离， 当结晶温度过低时，部分afg也同时析出而损失，且温度过低使得资源消耗增 加，故确定结晶温度为-20℃。
[0088]
对比实施例1：
[0089]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钠，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 计算得率和纯度。
[0090]
对比实施例2：
[0091]
精确称取2g afg粗品，置于5ml蒸馏水中并充分溶解，加入45.0ml冷 乙醇，使乙醇占比达到90％，混匀后加入30mg氢氧化钙，在0～4℃环境中搅 拌15min后，将溶液放置于-20℃中使精氨酸与糖沉降结晶，低温结晶6h后， 抽滤，分离液体与所结晶出的杂质，将上层清液低温冻干后称量，重复试验三次， 计算得率和纯度。
[0092]
结果如下：
[0093]
表5.不同氢氧化钠、氢氧化钙添加量影响afg纯化的统计表
[0094][0095]
由表5可知，将氢氧化钡替换为相同质量的氢氧化钠或者氢氧化钙，得率和 纯度均不及使用氢氧化钡。
[0096]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、 组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。