充分自裂解重组C1s蛋白的表达质粒组合、表达宿主细胞及表达方法与流程

本发明涉及一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达质粒组合、表达宿主细胞及表达方法，属于蛋白表达。

背景技术：

1、重组蛋白表达技术是指将编码目标蛋白的外源基因通过分子克隆的方法插入表达载体，随后使用表达载体侵染宿主细胞，通过宿主细胞自身的转录和翻译机制进行蛋白表达生产，再通过分离纯化获得目标蛋白的方法，至今已有50多年的历史。常用的表达用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。

2、c1s蛋白由两个亚基组成，其中其b亚基是一种丝氨酸蛋白酶。c1s蛋白是补体系统中蛋白级联的体系的重要组成元件之一，与c1q和c1r一起组成c1补体系统，是机体免疫机制的重要组成部分。c1r蛋白激活c1s蛋白，释放其蛋白酶活性，随即c1s蛋白进一步激活补体系统中的c2和c4蛋白，完成补体系统的级联反应。c1s蛋白是重要的药物靶点之一，其缺失会导致诸多免疫相关疾病，包括ehlers-danlos综合症，桥本氏甲状腺炎，肝炎等。因此，c1s蛋白具有重要的研究价值。科研用c1s蛋白通常通过重组蛋白表达技术制备，使用的主要宿主是哺乳动物细胞。常见哺乳动物细胞表达体系(比如hek293)宿主细胞含有一定的本底蛋白酶，可以部分裂解激活c1s蛋白，然而由于宿主细胞本底蛋白酶特异型较差，故表达的c1s蛋白通常无法被完全裂解激活，且批次间蛋白激活的比例差异性较大，因此无法制备具有生物学意义的完全激活的c1s蛋白。当前制备得到完全激活的具有充分生物学意义的c1s蛋白需要使用特殊的细胞系，比如小鼠骨髓瘤细胞系ns0，为一般实验室获得研究用c1s蛋白带来了巨大的挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达质粒组合，能直接培养获得激活c1s蛋白。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达质粒组合，其中质粒一中含有c1s蛋白的表达基因，质粒二中含有c1r蛋白的表达基因，其中c1s蛋白的表达基因编码的c1s蛋白c末端携带纯化标签，其中c1r蛋白的表达基因编码的c1r蛋白不引入纯化标签。

4、优选的，所述纯化标签为his标签。

5、优选的，其中c1s蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，c1r蛋白的氨基酸序列如seq idno.4所示。

6、本发明还公开了一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达宿主细胞，系转染有上述两个表达质粒的哺乳动物细胞系。

7、优选的，所述哺乳动物细胞系为hek293细胞。

8、本发明还公开了一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达方法，其步骤包括：

9、(1)构建重组蛋白表达质粒：构建权利要求1-3中任一项所述的表达质粒组合；

10、(2)将构建好的两个重组蛋白表达质粒转染到哺乳动物细胞系中，培养转染后的哺乳动物细胞系；

11、(3)收集培养液上清，过镍离子亲和层析柱，然后洗脱，收集含有目标蛋白的洗脱峰，获得c1s蛋白。

12、优选的，所述哺乳动物细胞系为hek293细胞。

13、优选的，洗脱液为20mmtris,ph7.4，150mmnacl，1m咪唑。

14、优选的，步骤(2)具体为：用无血清cd培养基传代培养hek293细胞，调节细胞密度至0.5～1x106时，将构建好的重组蛋白表达质粒与转染试剂以质量比1：1混合，随后加入细胞中进行转染，转染后第1、3、5天添加293无血清加料液进行细胞培养。

15、优选的，培养至少7天后，收集培养液上清，过滤后加样至镍离子亲和层析柱，随后使用含10mm咪唑的tris缓冲液进行平衡，平衡完成后使用线性咪唑浓度梯度洗脱，收集含有目标蛋白的洗脱峰；含10mm咪唑的tris缓冲液为20mmtris,ph7.4，150mmnacl，10mm咪唑；洗脱缓冲液为20mmtris,ph7.4，150mmnacl，1m咪唑。

16、本发明借用c1s蛋白的级联机制，通过在表达c1s蛋白的同时共转表达其上游c1r蛋白，从而在宿主细胞中引入特异型激活c1s蛋白的机制，获得充分自裂解的重组c1s蛋白。使用该方法可以通过利用实验室常用哺乳动物细胞表达体系(比如hek293)制备获得充分裂解的c1s蛋白。

技术特征：

1.一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达质粒组合，其特征在于质粒一中含有c1s蛋白的表达基因，质粒二中含有c1r蛋白的表达基因，其中c1s蛋白的表达基因编码的c1s蛋白c末端携带纯化标签，其中c1r蛋白的表达基因编码的c1r蛋白不引入纯化标签。

2.根据权利要求1所述的表达质粒组合，其特征在于所述纯化标签为his标签。

3.根据权利要求1所述的表达质粒组合，其特征在于其中c1s蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，c1r蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

4.一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达宿主细胞，其特征在于：系转染有权利要求1-3中任一项所述的两个表达质粒的哺乳动物细胞系。

5.根据权利要求4所述的表达宿主细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞系为hek293细胞。

6.一种充分自裂解重组c1s蛋白的表达方法，其特征在于其步骤包括：

7.根据权利要求6所述的充分自裂解重组c1s蛋白的表达方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞系为hek293细胞。

8.根据权利要求6所述的充分自裂解重组c1s蛋白的表达方法，其特征在于：洗脱液为20mmtris,ph7.4，150mmnacl，1m咪唑。

9.根据权利要求6所述的充分自裂解重组c1s蛋白的表达方法，其特征在于：步骤(2)具体为：用无血清cd培养基传代培养hek293细胞，调节细胞密度至0.5～1x106时，将构建好的重组蛋白表达质粒与转染试剂以质量比1：1混合，随后加入细胞中进行转染，转染后第1、3、5天添加293无血清加料液进行细胞培养。

10.根据权利要求6所述的充分自裂解重组c1s蛋白的表达方法，其特征在于：步骤(3)具体为：培养至少7天后，收集培养液上清，过滤后加样至镍离子亲和层析柱，随后使用含10mm咪唑的tris缓冲液进行平衡，平衡完成后使用线性咪唑浓度梯度洗脱，收集含有目标蛋白的洗脱峰；含10mm咪唑的tris缓冲液为20mmtris,ph7.4，150mmnacl，10mm咪唑；洗脱缓冲液为20mmtris,ph7.4，150mmnacl，1m咪唑。

技术总结
本发明公开了一种充分自裂解重组C1s蛋白的表达质粒组合。组合中含有两个质粒，分别含有C1s蛋白的表达基因以及C1r蛋白的表达基因，其中C1s蛋白的表达基因编码的C1s蛋白C末端携带纯化标签，其中C1r蛋白的表达基因编码的C1r蛋白不引入纯化标签。本发明还公开了其表达宿主细胞和表达方法。本发明借用C1s蛋白的级联机制，通过在表达C1s蛋白的同时共转表达其上游C1r蛋白，从而在宿主细胞中引入特异型激活C1s蛋白的机制，获得充分自裂解的重组C1s蛋白。使用该方法可以通过利用实验室常用哺乳动物细胞表达体系(比如HEK293)制备获得充分裂解的C1s蛋白。

技术研发人员：陈宇宁,张学娇,朱小冬,何群香,刘付丽,吉庆庆,党建利,高然,宫元伟,姜威,张旭,张杰,徐文涛,刘国虎
受保护的技术使用者：义翘神州（泰州）科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5