CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法与流程

本发明涉及属于癌症体外临床检测
技术领域：
，尤其涉及CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法。
背景技术：
：近半个世纪以来，肿瘤的发病率和死亡率逐年升高，成为医学界热点中的热点。20世纪70年代，美国提出的向“肿瘤进军”反映了社会对肿瘤死亡率居高不下的焦虑，同时，在过去的几十年中，肿瘤标志在技术上和定义上有了突破，这一切都促使了肿瘤标志研究的快速发展。CA215是肿瘤相关抗原，该抗原是1987年对从培养的卵巢癌细胞提取的单克隆抗体RP215发现的。RP215被证明与位于主要由大多数癌细胞中表达的免疫球蛋白重链(一般称为CA215)碳水化合物相关的表位发生反应。由于CA215是高度与癌细胞或癌组织相关联的，且一般不能在正常人组织中发现，除了在增生上皮细胞或组织，例如皮肤、食道、子宫颈以及几个免疫特殊部位，包括神经，眼睛和睾丸。CA215作为一个泛癌生物标志物的具有潜在应用价值，并且可以与其它已知的癌症生物标志物的并行比较来记录CA215的在人类许多不同类型的癌症的免疫诊断的临床应用。发现癌症患者和正常人血清CA215水平是显著差异(P<0.001)。由于临床分期，在卵巢癌的情况下，相比正常个体其阳性率范围从58-86％不等。对于宫颈癌患者，在癌症晚期的阶段阳性率分别高达66-94％。宫颈癌和卵巢癌这些临床研究的结果还表明，平均血清CA215水平在术前阶段并在一周外科手术或化疗或放疗之前之内维持在相当高的水平。相反，当手术操作或化疗或放疗七天后测定，血清CA215水平显著下降。基于这些研究，可以得出结论认为，癌症患者的子宫颈和卵巢癌之间的手术切除或化学治疗导致在CA215水平在统计学上显著减少。结果表明，CA215在癌症患者中最可能从肿瘤部位产生，且该肿瘤负荷可由癌症患者的血清CA215水平充分地反映检测到。因此，癌症患者的血清CA215水平的例行检测对监测癌症发展的计划之后治疗或手术治疗的状态是有益的。作为一个泛癌标志物，CA215比癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)或β2微球蛋白更好，在大多数癌症中具有更高的显示阳性检出率。对于大多数人类癌症CA215阳性检出率都比较高，包括卵巢癌。然而，在子宫颈癌的情况下，使用CA215组合检测比单独用CA125有更高的检出率，检出率从13％提升至81％。然而，对于卵巢癌用CA215和CA125的组合也有更好的检出率，检测率从59％提升至82％。对于肺癌，CA215和CYFRA21-1组合检测也具有较好的阳性检出率。对于肝癌，CEA或甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)与CA215的组合似乎有更高的阳性检出率。总之，其他癌症生物标志物与CA215的组合可以提高在常规临床诊断癌症中的阳性检出率。上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)和酶免疫((enzymeimmunoassay，EIA)相似，不同这处是以发光物质作为底物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。化学发光分析系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。技术实现要素：本发明提供一种CA215检测试剂盒，可以定量检测人类癌症标志物CA215的浓度，具有灵敏度高、线性范围宽、非特异性低和稳定性能好的优点。本发明提供的CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液以及校准品；其中，所述磁分离剂为包被CA215抗体的磁微粒溶液；所述化学发光底物液为二乙醇胺缓冲液，所述二乙醇胺缓冲液包含3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐；所述校准品采用CA215纯品配制，其标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。优选的，所述磁分离剂按照以下方法制备：(1)活化磁微粒：取充分混匀后的羧基磁微粒放于离心管中，将离心管放置于磁分离架上，待羧基磁微粒完全被吸附分离后，去除上清液，加入MES缓冲液洗涤羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液将羧基磁微粒活化；(2)包被磁微粒：用MES缓冲液洗涤活化后的羧基磁微粒至少一次，将离心管置于磁分离架上，分离去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗体混匀，在室温下反应2～4小时，反应结束后，再将离心管置于磁分离架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗涤至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于离心管中，室温反应2～4小时，反应结束后，去除上清液保存，其中，羧基磁微粒与CA215抗体的体积比为1：1；(3)采用磁珠悬浮液液将步骤(2)制备的包被磁微粒稀释至0.1～1mg/ml。优选的，所述羧基磁微粒为Fe3O4/Fe2O3磁性纳米粒子和有机高分子材料的聚合物，其平均粒径为0.5～5μm，优选1～3μm，且所述羧基磁微粒表面带有羧基、氨基和羟基中的一种或多种基团。优选的，上述磁珠悬浮液按照以下方法配制：称取Tris-碱1.21g、氯化钠4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的纯化水，混匀后静置10min后用盐酸或氢氧化钠调节PH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明胶、1mol/L的氯化镁0.5ml、1mol/L的氯化锌0.05ml、1mol/L的氯化钙0.1ml和0.5mL的T-20，用纯化水定容到500mL，过滤得到磁珠悬浮液。优选的，所述示踪物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯中的至少一种，优选碱性磷酸酶。优选的，所述示踪物标记的CA215抗体中CA215抗体浓度为1～300ng/ml。本发明同时提供一种CA215检测试剂盒的制备方法，所述CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液、校准品以及洗涤液，其制备方法包括如下步骤：(1)制备磁分离试剂活化磁微粒：取羧基磁微粒于离心管中并充分混匀，将离心管放置于磁分离架上，待羧基磁微粒完全被吸附分离后，去除上清液，加入MES缓冲液洗涤羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液将羧基磁微粒活化；包被磁微粒：用MES缓冲液洗涤活化后的羧基磁微粒至少一次，将离心管置于磁分离架上，分离去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗体混匀，在室温下反应2～4小时，反应结束后，再将离心管置于磁分离架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗涤至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于离心管中，室温反应2～4小时，反应结束后，去除上清液保存，其中羧基磁微粒与CA215抗体的体积比为1：1；采用磁珠悬浮液将制备的包被磁微粒稀释至0.1～1mg/ml得到磁分离剂的工作液；(2)制备示踪物标记的CA215抗体：活化碱性磷酸酶：取20mg/ml的碱性磷酸酶置于反应试管的底部，加入过量的40mmol/L的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，震荡混匀，室温条件下静置反应10～30min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液中和多余的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，反应10min后用Zeba脱盐柱纯化，得到活化的碱性磷酸酶；活化CA215抗体：取5mg/ml的CA215单克隆抗体置于反应试管的底部，加入过量的0.5mol/L的TCEP溶液，震荡混匀，室温条件下静置反应30-60min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液中和多余的TCEP溶液，反应10分钟，结束后马上用Zeba脱盐柱纯化，得到活化的CA215抗体；将活化好的碱性磷酸酶和活化好的CA215抗体按质量比1:1混合，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛层析的方法得到纯化好的CA215抗体-酶结合物；采用工作稀释液将纯化好的CA215抗体-酶结合物稀释至1～300ng/ml，得到示踪物标记的CA215抗体的工作液；(3)配制化学发光底物液：分别称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐0.2g、荧光增白剂2.5-二-双(苯并恶唑-2-)噻吩0.1g、牛血清蛋白5g、BDMQ表面活性剂1g和proclin30010g，然后加入0.4mmol/L的MgSO40.1ml、0.8mmol/LZnCl20.1ml和0.1mol/L的二乙醇胺缓冲液500ml，混匀15分钟，然后加入0.1mol/L的二乙醇胺缓冲液定容到1000ml，混匀过滤待用，放置在2-8℃条件下避光保存；(4)配制校准品系列：采用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释CA215纯品，得到校准品，所述磷酸盐缓冲液包括质量分数为3％的BSA和0.05％的防腐剂，其中防腐剂为Proclin-300，所述校准品系列的标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml和100AU/ml；(5)配制洗涤液：取三羟甲基氨基甲烷2.24g、8.76g氯化钠和0.5ml吐温-20加水定容至1000ml，混匀过滤即可；(6)将磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液、校准品以及洗涤液组装成所述CA215检测试剂盒。优选的，所述制备磁分离剂的步骤中，所述磁珠悬浮液按照以下方法配制：称取Tris-碱1.21g、氯化钠4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的纯化水，混匀后静置10min后用盐酸或氢氧化钠调节pH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明胶、1mol/L的氯化镁0.5ml、1mol/L的氯化锌0.05ml、1mol/L的氯化钙0.1ml和0.5mL的T-20，用纯化水定容到500mL，混匀过滤得到磁珠悬浮液液。优选的，所述制备示踪物标记的CA215抗体的步骤中，所述工作稀释液各组分含量如下:1％-5％体积的牛血清白蛋白、1-5％体积的鼠血清、1-10％体积的新生牛血清、1-5％体积的马血清、1-5％体积的猪血清、8g/L的氯化钠、0.2g/L的氯化钾、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、10-30g/L海藻糖、0.1～1g/L4-甲酰苯基硼酸、0.1-5％体积的丙三醇、0.1-3％体积的乙二醇、0.1-20g/L黄原胶、0.01-1％体积的吐温-20、0.1-1g/L乙二胺四乙酸、1％体积的Proclin-300、0.1-0.5％体积的庆大霉素。本发明还提供一种采用上文所述的CA215检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：取出CA215检测试剂盒，将所述CA215检测试剂盒平衡至室温，并将所述CA215检测试剂盒中的试剂取出备用；取出待测的血清样本平衡至室温；按照校准品和待测的血清样本的数量准备反应管，并且编号，分别向试管中加入50μl的血清样本以及校准品，然后向每支试管中加入100μl示踪物标记的CA215抗体，再分别加入25μl的磁分离剂，37℃下充分振荡，然后置于磁分离架上分离；倒出上清液，用洗涤液清洗；每个反应管内均加入化学发光底物100μl，充分混匀后放入化学发光测量仪中进行检测；获取检测结果：直接读取各反应管的化学发光强度RLU值，以校准品的浓度值为横坐标，校准品的RLU值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算出待测的血清样本的浓度值，直接从化学发光测量仪读取或导出。相较于现有技术，本发明提供的CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法，具有以下有益效果：一、本发明提供的CA215检测试剂盒，是一种新的肿瘤标志物，其他癌症生物标志物与CA215的组合可以提高在常规临床诊断癌症中的阳性检出率。并且本试剂的反应模式是夹心法，特异性好，灵敏度高，无HOOK效应，线性范围广；二、本发明将羧基磁微粒引入到免疫检测技术当中，使试剂反应的体系均一，能极大地提高抗原抗体结合的效率，缩短了反应时间；三、碱性磷酸酶的标记不同于一般的戊二醛法和过碘酸钠法，所用的双功能交联法，使试剂盒具备更高的灵敏度和线性范围，并且非特异性低，稳定性好。四、由于采用了公司底物液的AMPPD/新增强剂技术，发光底物液灵敏度高、发光持续时间长，极大的提高了试剂的灵敏度。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1为本发明提供的CA215检测试剂盒CA215检测剂量-反应标准曲线；图2为本发明提供的CA215检测试剂盒的制备方法步骤流程图；图3为本发明提供的CA215检测试剂盒的使用方法步骤流程图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。本发明的技术原理如下：本发明采用化学发光免疫分析技术检测泛癌标志物CA215的浓度值，在反应管中加入CA215校准品或待测血清样本，再加入示踪物标记的CA215单克隆抗体进行反应，再加入包被CA215单克隆抗体的磁微粒溶液，包被的CA215单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的CA215单克隆抗体分别与CA215抗原分子的不同表位结合，形成“三明治”结构。没有结合的碱性磷酸酶标记的CA215单克隆抗体在洗涤步骤中被除去。加入化学发光底物液，在发光仪上读取发光值(RLU)，发射的光的强度与样品中的CA215浓度成正比，通过CA215检测剂量-反应标准曲线即可定量获得CA215的浓度值，CA215检测剂量-反应标准曲线如图1所示。实施例中CA215抗体和CA215纯品由加拿大不列颠哥伦比亚大学的QegoryLee教授赠与，磁微粒购于日本JSR公司。实施例一CA215检测试剂盒所述CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液、校准品以及洗涤液。所述磁分离剂为包被CA215抗体的磁微粒溶液，所述磁分离剂中CA215抗体的包被浓度为0.1～1mg/mL。其中，磁微粒为Fe3O4/Fe2O3磁性纳米粒子和有机高分子材料的聚合物，即Fe3O4/Fe2O3为内核，其微球表面带有羧基、氨基和羟基中的一种或多种基团。所述磁微粒平均粒径为0.5～5μm，优选1～3μm。所述示踪物标记的CA215抗体中的用于标记CA215抗体的示踪物可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯中的至少一种，优选碱性磷酸酶。所述示踪物标记的CA215抗体中CA215抗体浓度为1～300ng/ml。所述化学发光底物液为二乙醇胺缓冲液，每升二乙醇胺缓冲液中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.2g、荧光增白剂2.5-二-双(苯并恶唑-2-)噻吩(EBF)0.1g、牛血清蛋白(BSA)5g、BDMQ表面活性剂1g和proclin30010g、0.4mmol/L的MgSO40.1ml和0.8mmol/LZnCl20.1ml，其余为0.1mol/L的二乙醇胺。所述校准品采用CA215纯品配制，在本实施例中，共配制了6种标示浓度的校准品，其标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。所述洗涤液为pH7.0～8.0的中性缓冲液，取三羟甲基氨基甲烷2.24g、8.76g氯化钠和0.5ml吐温-20加水定容至1000ml，混匀过滤即可。请参阅图2，为本发明提供的CA215检测试剂盒的制备方法步骤流程图。实施例二CA215检测试剂盒的制备方法所述CA215检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：1)制备磁分离剂：活化磁微粒：充分混匀羧基磁微粒后，取100μl的羧基磁微粒到1.5ml的离心管中，置于磁分离架上，待分离后去除上清液，取200μl100mmol/L的MES缓冲液(pH5.0)加入到离心管中，置于磁分离架上，待分离后去除上清液，重复清洗3次，迅速加入新配制的50μl50mg/ml的EDC溶液和50μl50mg/ml的NHS溶液到装有羧基磁微粒的离心管中，混匀羧基磁微粒充分悬浮，室温下反应30min，反应结束后，用100μl100mmol/L的MES缓冲液(pH5.0)洗涤3次；包被磁微粒：将上述活化好的羧基磁微粒置于磁分离架上，分离去除上清液，加入100μl2.5mg/ml的CA215抗体，清柔的混匀；在室温下反应2h；反应结束后将离心管置于磁分离架上，去除上清液，加入100μl3mol/L的乙醇胺溶液(pH9.0)洗涤3次，然后再加入100μl3mol/L的乙醇胺溶液(pH9.0)于离心管中，室温反应2h，反应结束后，去除上清液，加入适量的保存液保存，所述保存液为含有1％BSA和0.1mol/LPBS的缓冲液，其pH＝7.4；采用磁珠悬浮液将上述CA215抗体包被的羧基磁微粒稀释至0.1～1mg/ml，即所述磁分离剂包被的CA215抗体浓度为0.1～1mg/ml，得到磁分离剂的工作液。其中所述磁珠悬浮液按照以下方法配制：称取Tris-碱1.21g、氯化钠4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的纯化水，混匀后静置10min后用HCl或NaOH调节pH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明胶、1mol/L的氯化镁0.5ml、1mol/L的氯化锌0.05ml、1mol/L的氯化钙0.1ml和0.5mL的T-20，用纯化水定容到500mL，混匀过滤得到磁珠悬浮液。2)制备示踪物标记的CA215抗体：(1)活化碱性磷酸酶：取0.02ml20mg/ml的碱性磷酸酶置于反应试管的底部，称取2mg的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)，用纯化水溶解至40mmol/L(17.5mg/ml)，在含有碱性磷酸酶的反应试管中加入5ul的40mmol/L的sulfo-smcc溶液，震荡混匀，室温条件下静置反应10-30min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液0.5μl中和多余的sulfo-smcc，反应10min，结束后马上用Zeba脱盐柱纯化，得到活化的碱性磷酸酶；(2)活化CA215抗体：取0.5ml5mg/ml的CA215单克隆抗体置于反应试管的底部，称取6mg的TCEP，用pH7.2的PBS溶解得到0.5mol/L的TCEP溶液，在含有CA215抗体的反应试管中加入50μlTCEP溶液，震荡混匀，室温条件下静置反应30-60min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液1μl中和多余的TCEP，反应10分钟，结束后马上用Zeba脱盐柱纯化，得到活化的CA215抗体；(3)将上述活化好的抗体和活化好的碱性磷酸酶按质量比1:1混合，在2-8℃条件下反应12h，反应结束后用分子筛层析的方法得到纯化好的CA215抗体-酶结合物；采用工作稀释液将纯化好的CA215抗体-酶结合物稀释至1～300ng/ml，即所述示踪物标记的CA215抗体中CA215抗体浓度为1～300ng/ml，得到示踪物标记的CA215抗体工作液。其中所述工作稀释液各组分含量如下:1％-5％体积的牛血清白蛋白、1-5％体积的鼠血清、1-10％体积的新生牛血清、1-5％体积的马血清、1-5％体积的猪血清、8g/L的氯化钠、0.2g/L的氯化钾、2.9g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、10-30g/L海藻糖、0.1～1g/L4-甲酰苯基硼酸、0.1-5％体积的丙三醇、0.1-3％体积的乙二醇、0.1-20g/L黄原胶、0.01-1％体积的吐温-20、0.1-1g/L乙二胺四乙酸、1％体积的Proclin-300、0.1-0.5％体积的庆大霉素。3)配制化学发光底物液：分别称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.2g、荧光增白剂2.5-二-双(苯并恶唑-2-)噻吩(EBF)0.1g、牛血清蛋白(BSA)5g、BDMQ表面活性剂1g和proclin30010g，然后加入0.4mmol/L的MgSO40.1ml、0.8mmol/LZnCl20.1ml和0.1mol/L的二乙醇胺缓冲液500ml，混匀15分钟，然后加入0.1mol/L的二乙醇胺缓冲液定容到1000ml，混匀过滤待用，放置在2-8℃条件下避光保存；4)配制校准品：采用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释CA215纯品，定标得到校准品，所述磷酸盐缓冲液包括质量分数为3％的BSA和0.05％的防腐剂，其中防腐剂为Proclin-300，所述校准品的标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml和100AU/ml。5)配制洗涤液：取三羟甲基氨基甲烷2.24g、8.76g氯化钠和0.5ml吐温-20加水定容至1000ml，混匀过滤即可。6)将磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液、校准品以及洗涤液组装成所述CA215检测试剂盒。请参阅图3，为本发明提供的CA215检测试剂盒的使用方法步骤流程图。实施例三CA215检测试剂盒的使用方法CA215检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：S1、取出CA215检测试剂盒，将所述CA215检测试剂盒平衡至室温，并将所述CA215检测试剂盒中的试剂取出备用：具体地，将所述CA215检测试剂盒置室温(18～25℃)下平衡30分钟；S2、取出待测的血清样本平衡至室温：具体地，将待测的血清样本置室温(18～25℃)平衡30分钟。S3、按照校准品和待测的血清样本的数量准备试管，并且编号，分别向试管中加入50μl的血清样本以及校准品，然后每支试管中加入100μl示踪物标记的CA215抗体，再分别加入25μl的磁分离剂，37℃下充分振荡，然后置于磁分离架上分离；具体地，试管数量为7个，每个试管内分别加入浓度为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml和100AU/ml的六个校准品以及待测的血清样本；S4、倒出上清液，用洗涤液清洗；S5、每个试管内均加入化学发光底物100μl，充分混匀后用化学发光测量仪中进行检测；S6、获取检测结果：直接读取测量各试管的化学发光强度RLU值，以校准品的浓度值为横坐标，校准品的RLU值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算出待测的血清样本的浓度值，直接从化学发光测量仪读取或导出。实施例四CA215检测试剂盒的分析性能评价首先利用化学发光免疫分析仪对CA215标准品进行检测，绘制检测剂量-反应标准曲线，参见图1所示，所述标准曲线内置于电脑软件中，接着测试已知含量样品和校准品等，读取发光值或根据剂量-反应标准曲线计算出发光值对应的浓度，对所述CA215检测试剂盒进行准确性、特异性、精密度、最低检测限和稳定性的评价。1)准确性CA215定量检测试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及鉴定规程对实施例1的CA215检测试剂盒进行检定结果如下：将已知含量样品用本发明实施例1中制备的试剂盒进行检测，计算回收率(回收率＝回收量/加入量×100％)，结果如下表所示：加入量AU/ml5102550回收量AU/ml4.9410.6526.1151.02回收率％98.80106.50104.44102.042)特异性将已知含量类似物用本发明实施例1中的CA215检测试剂盒进行检测，结果如下表所示：3)精密性检测浓度分别为5AU/ml的质控品1和50AU/ml的质控品2的发光值，质控品1和质控品2的浓度分别做10个平行孔重复测定其发光值，计算CV值(CoefficientofVariance，离散系数，为标准偏差与平均值比值的百分比)，结果如下表所示：4)最低检测限重复测定标示浓度为零的校准品(或样本稀释液)10次，计算出发光值的均值和标准差(SD)，将的反应量代入CA215检测剂量-反应曲线，计算出相应浓度值，即为最低检测限，结果如下表所示：5)稳定性试剂盒中各组分置37℃7天后测试准确性，最低检测限，精密度，曲线相关系数，结果如下：将以上结果汇总得出：检测项目检验标准检验结果准确性回收率在95％～110％符合标准特异性本试剂盒测定结果应不大于1AU/ml符合标准精密性CV(％)小于15％(n＝10)符合标准灵敏度小于1AU/ml符合标准稳定性试剂盒中各组分置37℃至少7天符合标准从上述汇总表可以看到说明所述CA215检测试剂盒各项性能指标均合格，且具有准确性高、特异性高、精密性好、灵敏度高和稳定性好的优点。实施例五：正常人的CA215的含量和临界值的确定随机抽取200例健康人血清用实施例1中的CA215检测试剂盒进行测定，汇总所有测定值，以百分位数法确定其临界值(95％位数的参考限)，参考值范围≤6.3AU/ml。实施例六：随机抽取60例卵巢癌患者血清，用实施例1中的制备的CA215定量试剂盒进行测定，汇总所有测定值，平均浓度为20.74AU/ml，显著高于健康人血清测值。实施例七：随机抽取60例宫颈癌患者血清，用实施例1中的制备的CA215定量试剂盒进行测定，汇总所有测定值，平均浓度为31.08AU/ml，显著高于健康人血清测值。本发明提供的CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法，具有以下有益效果：一、本发明提供的CA215检测试剂盒，是一种新的肿瘤标志物，其他癌症生物标志物与CA215的组合可以提高在常规临床诊断癌症中的阳性检出率。并且本试剂的反应模式是夹心法，特异性好，灵敏度高，无HOOK效应，线性范围广；二、本发明将羧基磁微粒引入到免疫检测技术当中，使试剂反应的体系均一，能极大地提高抗原抗体结合的效率，缩短了反应时间；三、碱性磷酸酶的标记不同于一般的戊二醛法和过碘酸钠法，所用的双功能交联法，使试剂盒具备更高的灵敏度和线性范围，并且非特异性低，稳定性好。四、由于采用了公司底物液的AMPPD/新增强剂技术，发光底物液灵敏度高、发光持续时间长，极大的提高了试剂的灵敏度。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3