ST2蛋白检测试剂盒和检测方法与流程

st2蛋白检测试剂盒和检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及st2蛋白检测试剂盒和检测方法。


背景技术：

2.可溶性生长刺激表达基因2蛋白(souble growth stimμlation expressed gene 2，sst2或st2)是白细胞介素1受体/toll样受体超家族的成员，在免疫和炎症反应中起到关键作用。st2由328个氨基酸组成，包括由9个氨基酸组成的独特c端序列，分子量为36993da。st2主要在心肌细胞、心脏成纤维细胞、肥大细胞以及辅助性t细胞(th)类淋巴细胞的表面进行表达，表达后可以分泌到细胞外。心肌细胞和成纤维细胞受到机械牵张时可以表达st2l和st2，st2与白介素33(il
‑
33)结合，阻断il
‑
33/st2l信号传导，从而抑制核因子
‑
κb和丝裂原活化蛋白激酶的激活，进而减弱心肌保护作用、促进心脏损伤及重塑。st2也是重要的心室重构和心脏纤维化的标志物，st2含量显著性地升高可以反映全身组织尤其心肌组织纤维化过程的加剧。测定st2蛋白浓度可用于辅助判断和预后评价多种心血管疾病，例如急性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性冠状动脉综合征等。
3.目前，市场用于检测st2蛋白的方法主要是化学发光法、免疫层析法、酶联免疫吸附测定法、胶乳增强免疫比浊法等。免疫层析法灵敏度较低，易受杂散光干扰；市面上主流的critical diagnostics公司的酶联免疫法试剂盒，操作流程繁琐，检测时间长，产生较多样本污染废液；胶乳增强免疫比浊法、化学发光法的成本较高、检测时间长，且需要配套价格昂贵的全自动分析系统进行检测。
4.上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提出一种st2蛋白检测试剂盒和检测方法，旨在提高检测st2蛋白的准确性。
6.为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种st2蛋白检测试剂盒，包括：
7.第一试剂，所述第一试剂包括磁微粒偶联的st2蛋白抗体；
8.第二试剂，所述第二试剂包括酶标记的st2蛋白抗体；以及
9.第三试剂，所述第三试剂包括裸st2蛋白抗体；
10.其中，所述裸st2蛋白抗体的浓度大于所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度。
11.可选地，所述裸st2蛋白抗体的浓度为大于或等于1.5ng/ml，且小于或等于2.5ng/ml。
12.可选地，所述磁微粒被甲苯磺酰基化。
13.可选地，所述磁微粒的直径为大于或等于1.0μm，且小于或等于3.0μm。
14.可选地，所述磁微粒的浓度为大于或等于0.05mg/ml，且小于或等于0.4mg/ml。
15.第二方面，本发明提出一种st2蛋白检测方法，包括以下步骤:
16.(1)依次混合待测样品、第一试剂、第二试剂和第三试剂，依次混合校准品、第一试
剂、第二试剂和第三试剂，分别孵育并洗涤后加入底物发光液；
17.(2)检测所述底物发光液的相对发光强度，通过检测得到的相对发光强度，计算st2蛋白的浓度；
18.其中，所述第一试剂包括磁微粒偶联的st2蛋白抗体，所述第二试剂包括酶标记的st2蛋白抗体，所述第三试剂包括裸st2蛋白抗体，所述裸st2蛋白抗体的浓度大于所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度。
19.本发明st2蛋白检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；所述第一试剂包括磁微粒偶联的st2蛋白抗体；所述第二试剂包括酶标记的st2蛋白抗体；所述第三试剂包括裸st2蛋白抗体；其中，所述裸st2蛋白抗体的浓度大于所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度；裸st2蛋白抗体与酶标记的st2蛋白抗体竞争性地结合抗原，当样本中st2蛋白抗原的浓度比较低时，抗原主要被具有浓度优势的裸st2蛋白抗体结合，导致相对发光强度的检测值明显低于未添加裸st2蛋白抗体的检测值，但是，随着抗原浓度的不断上升，裸st2蛋白抗体结合抗原的浓度优势逐渐减弱，两种检测值之间的差异也不断减小；裸st2蛋白抗体拉大了不同浓度st2蛋白抗原的检测值之间的差距，使得不同浓度st2蛋白抗原的检测值的区分度更显著，这样，提高了检测结果的准确性。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
21.图1为实施例一本发明试剂盒的线性范围检测结果图；
22.图2为实施例一不同浓度的第三试剂的检测结果图；
23.图3为实施例四两种试剂盒检测结果的相关性分析图；
24.图4为实施例四两种试剂盒检测结果的一致性分析图。
25.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
26.需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案，或b方案，或a和b同时满足的方案。
27.本发明提出一种st2蛋白检测试剂盒。
28.本发明提出的st2蛋白检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；所述第一试剂包括磁微粒偶联的st2蛋白抗体；所述第二试剂包括酶标记的st2蛋白抗体；所述第三试剂包括裸st2蛋白抗体；其中，所述裸st2蛋白抗体的浓度大于所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度。
29.在本发明试剂盒中，所述第一试剂还包括缓冲液(50～200mmol/l，ph＝7.0～
8.0)、电解质(50～200mmol/l)、表面活性剂(0.2～1.0g/l)、稳定剂(0.2～1.0g/l)、防腐剂(0.2～1.0g/l)。其中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、甘氨酸
‑
氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液、4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
1乙烷磺酸(hepes)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(taps)缓冲液、2
‑
吗啉乙磺酸(mes)、3
‑
吗啉丙磺酸(mops)缓冲液、硼酸缓冲液中的至少一种，上述多种缓冲液可以以任意比例混合。所述电解质包括阴离子电解质(例如na
+
、k
+
、mg
2+
、zn
2+
)或阳离子电解质(例如cl
‑
、hco3‑
、so
42
‑
)的至少一种。所述表面活性剂包括吐温
‑
20。所述防腐剂包括proclin150、proclin200、proclin300或proclin5000中的至少一种，上述多种防腐剂溶液可以以任意比例混合。所述第一试剂中的所述st2蛋白抗体可以为单克隆抗体，这样所述st2蛋白抗体可以结合单一的抗原表位，具有高度的特异性。当然，所述st2蛋白抗体也可以为多克隆抗体。
30.所述第二试剂还包括缓冲液(50～200mmol/l，ph＝7.0～8.0)、电解质(50～200mmol/l)、表面活性剂(0.2～1.0g/l)、稳定剂(0.2～1.0g/l)、防腐剂(0.2～1.0g/l)、st2抗体(0.02～1.60ng/ml)、酶(0.02ng/ml～1.60ng/ml)。其中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、甘氨酸
‑
氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液、4
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑1‑
1乙烷磺酸(hepes)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(taps)缓冲液、2
‑
吗啉乙磺酸(mes)、3
‑
吗啉丙磺酸(mops)缓冲液、硼酸缓冲液中的至少一种，上述多种缓冲液可以以任意比例混合。所述电解质包括阴离子电解质(例如na
+
、k
+
、mg
2+
、zn
2+
)或阳离子电解质(例如cl
‑
、hco3‑
、so
42
‑
)的至少一种。所述表面活性剂包括吐温
‑
20。所述稳定剂包括酪蛋白、去激素人血清、牛血清白蛋白或小牛血清中的至少一种。所述防腐剂包括proclin150、proclin200、proclin300或proclin5000中的至少一种。所述第二试剂中的所述st2蛋白抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。标记所述st2蛋白抗体的酶可以为碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶的至少一种，不做限定。
31.所述第三试剂中的裸st2蛋白抗体为未被酶标记的st2蛋白抗体。所述第二试剂与所述第三试剂可以混合保存，也可以分别单独保存。所述裸st2蛋白抗体与所述酶标记的st2蛋白抗体竞争性地结合抗原，当样本中st2蛋白抗原的浓度比较低时，抗原主要被具有浓度优势的裸st2蛋白抗体结合，导致相对发光强度的检测值明显低于未添加裸st2蛋白抗体的检测值，但是，随着抗原浓度的不断上升，裸st2蛋白抗体结合抗原的浓度优势逐渐减弱，两种检测值之间的差异也不断减小；裸st2蛋白抗体拉大了不同浓度st2蛋白抗原的检测值之间的差距，使得不同浓度st2蛋白抗原的检测值的区分度更显著，这样，提高了检测结果的准确性。
32.本发明st2蛋白检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；所述第一试剂包括磁微粒偶联的st2蛋白抗体；所述第二试剂包括酶标记的st2蛋白抗体；所述第三试剂包括裸st2蛋白抗体；其中，所述裸st2蛋白抗体的浓度大于所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度；裸st2蛋白抗体与酶标记的st2蛋白抗体竞争性地结合抗原，当样本中st2蛋白抗原浓度比较低时，抗原主要被具有浓度优势的裸st2蛋白抗体结合，导致相对发光强度的检测值明显低于未添加裸st2蛋白抗体的检测值，但是，随着抗原浓度的不断上升，裸st2蛋白抗体结合抗原的浓度优势逐渐减弱，两种检测值之间的差异也不断减小；裸st2蛋白抗体拉大了不同浓度st2蛋白抗原的检测值之间的差距，使得不同浓度st2蛋白抗原的检测值的区分度更显著，这样，提高了检测结果的准确性。
33.请参阅图2，所述第三试剂的浓度可以为大于或等于1.5g/ml，且小于或等于2.5g/ml。具体地，所述第二试剂的浓度为1.0ng/ml，即所述裸st2蛋白抗体与所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度比为大于或等于3：2，且小于或等于5：2。当所述第三试剂的浓度小于1.5ng/ml时，所述试剂盒对不同浓度st2蛋白抗原的检测值的区分度不够显著；当所述第三试剂的浓度大于2.5ng/ml时，所述试剂盒对低浓度st2蛋白抗原的检测不灵敏。
34.在本发明中，所述磁微粒被甲苯磺酰基化。具体地，所述磁珠为tosyl磁珠，基本材质为fe2o3和聚苯乙烯，所述磁珠的表面涂层导入了甲苯磺酰基基团。甲苯磺酰基化的磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖，提高了磁微粒结合st2蛋白抗体的特异性，进而提高了检测的灵敏度。同时，本发明采用甲苯磺酰基化的磁微粒捕获st2蛋白抗体，甲苯基基团作为活性基团结合在磁微粒的表面上，使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下偶联抗体，简化了操作步骤，提高了检测st2蛋白浓度的效率。
35.为了实现比较好的偶联st2蛋白抗体的效果，所述磁微粒的直径可以为大于或等于1.0μm，且小于或等于3.0μm。当所述磁微粒的直径小于1.0μm时，单个所述磁微粒偶联多个所述st2蛋白抗体的数量比较少，最终影响检测效果。当所述磁微粒的直径大于3.0μm时，所述磁微粒在悬浮溶中容易沉降，也会影响到偶联所述st2蛋白抗体的效果，影响到检测效果。
36.所述磁微粒的浓度可以为大于或等于0.05mg/ml，且小于或等于0.4mg/ml。具体地，所述st2蛋白抗体的浓度为大于或等于0.02ng/ml，且小于或等于1.6ng/ml，当所述磁微粒的浓度小于0.05mg/ml时，所述磁微粒的数量过少，不足以结合足量的0.02ng/ml的所述st2蛋白抗体；当所述磁微粒的浓度大于0.4mg/ml，造成所述磁微粒的浪费。
37.所述第一试剂的制备过程如下：
38.1)取2mg甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，置于磁力架上，静置2min后磁分离上清，加入1ml的硼酸盐缓冲液(0.1m/mol，ph＝9.0)清洗3次，再加入200μl的硼酸盐缓冲液(0.1m/mol，ph＝9.0)重悬；
39.2)加入100μl的硫酸铵溶液(3m/mol)，加入40μg的st2蛋白抗体，37℃下混悬12h
‑
24h；
40.3)磁分离去上清，用1ml的硼酸盐溶液(0.1m/mol，ph＝9.0)清洗1次，加入200μl的硼酸盐溶液(0.1m/mol，ph＝9.0)、150μl的硫酸铵溶液(3m/mol)和100μl的tris缓冲液(50mm/mol)反应16
‑
24h；
41.4)取出，磁分离去上清，加入1ml的tris缓冲液(50mm/mol)清洗1次，用200ul的tris缓冲液(50mm/mol)重悬，得到磁微粒偶联的st2蛋白抗体；
42.5)用50mm/mol tris、0.1％(w/v)吐温
‑
20、0.1％proclin300(w/v)、0.9％(w/v)氯化钠和1.2％bsa的混合液(ph＝7.4)，将磁微粒偶联的st2蛋白抗体稀释到0.2mg/ml的浓度，放于2
‑
8℃保存，所述第一试剂制备完成。
43.所述第二试剂的制备过程如下：
44.1)取0.1μg的st2抗体，加入250μl的pbs缓冲液(0.1m/mol，ph＝7.0)混匀；
45.2)加入新配置的20～50μl的edc水溶液(10mg/ml)，活化30分钟，然后加入20～50μl的碱性磷酸酶(5mg/ml)混匀；
46.3)室温避光保存2小时后取出，用30kd的超滤柱除盐纯化，收集剩余溶液，加一半
体积的纯甘油，保存于
‑
20℃备用；
47.4)取碱性磷酸酶标记的st2蛋白抗体，用50mm/mol hepes、1.5％(w/v)bsa、0.1％(w/v)吐温
‑
20、0.1％(w/v)proclin300、0.9％(w/v)氯化钠、5mm/mol mgcl2的混合液(ph＝7.4)，按1:600倍将碱性磷酸酶标记的st2蛋白抗体稀释到1ng/ml，所述第二试剂的制备完成。
48.所述st2蛋白检测试剂盒还包括底物发光液、校准品和质控品。所述底物发光液包括碱性磷酸酶催化发光底物和辣根过氧化物酶催化发光底物中的至少一种，例如所述底物发光液为碱性磷酸酶催化发光底物hrp。所述校准品和质控品以纯品st2抗原配置而成。
49.本发明还提出一种st2蛋白检测方法，包括以下步骤:
50.(1)依次混合待测样品、第一试剂、第二试剂和第三试剂，依次混合校准品、第一试剂、第二试剂和第三试剂，分别孵育并洗涤后加入底物发光液；(2)检测所述底物发光液的相对发光强度，通过检测得到的相对发光强度，计算st2蛋白的浓度；其中，所述第一试剂包括磁微粒偶联的st2蛋白抗体，所述第二试剂包括酶标记的st2蛋白抗体，所述第三试剂包括裸st2蛋白抗体，所述裸st2蛋白抗体的浓度大于所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度。
51.st2蛋白浓度的具体检测步骤如下：
52.1)使用全自动化学发光仪(深圳天辰医疗科技有限公司，货号：cl
‑
2000)，方法学模式为双抗体夹心法，依次加入20μl样本、50μl所述第一试剂、100μl所述第二试剂；
53.2)37℃反应5min后，进行磁分离清洗，清洗3次；
54.3)加入300μl所述底物发光液；
55.4)将反应杯移到光电模块中采集光电值，仪器自动转换为浓度模式，显示测试结果。
56.实施例一、第三试剂提高检测准确性分析
57.采用本发明检测试剂盒与不包括第三试剂(其他成分一致)的试剂盒，分别对浓度为0.0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的定标品进行检测，并进一步分析本发明试剂盒的线性检测范围。其中，所述裸st2蛋白抗体的浓度为2.0ng/ml、所述酶标记的st2蛋白抗体的浓度为1.0ng/ml。请参阅表1，检测值比值为不同浓度定标品的检测值与3ng/ml定标品检测值的比值。表1的结果说明，与不包括第三试剂的试剂盒相比，在本发明试剂盒的检测结果中，多个检测值比值之间的差距更明显，这样使得本发明试剂盒对多个检测值之间的区分度更显著。如此，本发明检测试剂盒更有利于区分测试结果和后期定标曲线的制作，提高了定标后结果的准确性。
58.请参阅图1，本发明试剂盒检测st2蛋白的检测值的线性相关方程为y＝20039x+348830，r2＝0.9985，相关系数r＝0.9992，对st2蛋白的线性检测范围为3～200ng/ml。
59.表1添加与不添加裸st2蛋白抗体的检测及分析结果
[0060][0061]
本实施例接着对不同浓度的所述第三试剂的检测效果进行研究。具体地，所述裸st2蛋白抗体的浓度分别为0ng/ml、1.0ng/ml、1.5ng/ml、2.0ng/ml、2.5ng/ml和3.0ng/ml，定标品的浓度分别为0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，所述酶标记的st2抗体的浓度为1.0ng/ml。分别将不同浓度的所述裸st2蛋白抗体和所述酶标记的st2抗体混合，进而检测不同浓度的定标品的相对发光强度。
[0062]
请参阅表2和图2，表2中的数据为定标品的检测值(rlu)，图2中的数据为表2中不同浓度定标品的检测值与3ng/ml定标品的检测值的比值(相同裸st2蛋白抗体浓度下)，图2中的数据与表2中的数据为一一对应。表2中，虽然随着所述裸st2蛋白抗体的浓度的增加，同一浓度定标品的检测值不断下降，但是通过图2的数据可以看到，所述裸st2蛋白抗体的浓度不同，所述比值具有差异。
[0063]
图2中折线图由下往上依次是浓度为3ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的定标品的检测结果，折线上的点为所述比值，与折线图下方表格中的数据相对应。由图2可知，当所述裸st2蛋白抗体的浓度＜1.5ng/ml时，所述比值之间的差异不明显，即多个检测值之间的区分度不显著；当所述裸st2蛋白抗体的浓度在1.5～2.5ng/ml时，所述比值之间的差异明显，多个检测值之间的区分度显著；当浓度＞2.5ng/ml时，所述比值之间的差异开始变小，多个检测值之间的区分度变小，且当所述裸st2蛋白抗体的浓度为3.0ng/ml时，25ng/ml浓度以下的定标品的所述比值之间基本没有差异，检测值之间不具有区分度。以上结果说明，当所述裸st2蛋白抗体的浓度在1.5～2.5ng/ml时，多个检测值之间的区分度显著，本发明试剂盒的检测准确性高。
[0064]
表2添加裸st2蛋白抗体的检测结果
[0065]
[0066]
实施例二、灵敏度检测
[0067]
随机取本发明检测试剂盒的三批试剂(2.0ng/ml裸st2蛋白抗体)，对本发明检测试剂盒的灵敏度进行验证。按照检测标准，本实施例包括空白限(limit of blank，lob)检测、检出限(detection limit，lod)检测和功能灵敏度(functional sensitivity，fs)检测。空白限lob为空白样本被检测到的最大检测浓度。检出限lod为样本被检测到的最低检测浓度。fs为变异系数为20％时对应lod样品的平均浓度。lob检测采用5份接近0值的临床样本，每个样本均重复检测3次，连续检测4天，共得到60个检测数据。lod检测采用5份浓度范围为1～4倍lob的系列临床样本，每个样本均重复检测3次，连续检测4天，共得到60个检测数据。请参阅表3，第1批试剂的lob值为0.90ng/ml，第2批试剂的lob值为0.85ng/ml，第3批试剂的lob值为0.89ng/ml，符合lob值的检测标准；第1批试剂的lod值为2.98ng/ml，第2批试剂的lod值为2.99ng/ml，第3批试剂的lod值为3.02ng/ml，符合lod值的检测标准；第1批试剂的fs值为3.01ng/ml，第2批试剂的fs值为3.00ng/ml，第3批试剂的fs值为2.99ng/ml，符合fs值的检测标准。以上结果表明本发明检测试剂盒的检测灵敏度高。
[0068]
表3灵敏度检测
[0069]
指标第1批(ng/ml)第2批(ng/ml)第3批(ng/ml)lob0.900.850.89lod2.982.993.02fs3.013.002.99
[0070]
实施例三、精密度检测
[0071]
随机取本发明检测试剂盒的三批试剂(2.0ng/ml裸st2蛋白抗体)，分别对st2蛋白浓度为25ng/ml和100ng/ml的样品进行检测，来验证本发明检测试剂盒的精密度。两个st2蛋白样本各做10个平行测试，共获得30个检测结果。分别对30个检测结果的批内差及批间差进行计算。请参阅表4，第1批试剂检测25ng/ml样品的批内差的变异系数为3.32％，检测100ng/ml样品的批内差的变异系数为3.11％；第2批试剂检测25ng/ml样品的批内差的变异系数为3.33％，检测100ng/ml样品的批内差的变异系数为3.11％；第3批试剂检测25ng/ml样品的批内差的变异系数为2.96％，检测100ng/ml样品的批内差的变异系数为2.31％；三批试剂的批内差的变异系数均＜4％，符合检测标准。请参阅表5，三批试剂检测25ng/ml样品的批间差的变异系数为6.40％，检测100ng/ml样品的批间差的变异系数为6.29％；变异系数均＜7％，符合检测标准。以上结果说明，本发明检测试剂盒的精密度好。
[0072]
表4批内差检测分析结果
[0073]
[0074][0075]
表5批间差检测分析结果
[0076][0077]
[0078]
实施例四、与同类产品临床比对
[0079]
采用本发明检测试剂盒和critical diagnostics公司的st2酶联免疫法试剂盒，分别对200份临床血液样本进行检测，并对检测结果进行相关性分析，以检验本发明检测试剂盒的检测效果。请参阅图3，本发明检测试剂盒和critical diagnostics公司的st2酶联免疫法试剂盒的线性相关方程为y＝0.9944x+0.3331，r2＝0.9949，相关系数r＝0.9974＞0.975，k＝0.994∈(0.8，1.2)。请参阅图4，200份所述血液样本的配对数据的95％一致性界限为(
‑
7.2ng/ml，7.21ng/ml)，8/200配对数据在95％一致性界限以外，192/200份配对数据在95％一致性界限内。在95％一致性界限范围外的数据均属于高值样本，不影响样本的临床辅助诊断，这种差值幅度在临床上可以接受。以上分析结果表明，本发明检测试剂盒与critical diagnostics公司的st2酶联免疫法试剂盒的检测结果具有良好的一致性，临床比对几乎没有差异，说明本发明检测试剂盒的检测准确度高。
[0080]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。