一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法

本发明涉及酶蛋白残留检测
技术领域：
，具体领域为一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法。
背景技术：
：随着绿色化学的倡导，越来越多的手性医药中间体的制备使用生物酶作为手性催化剂，在常规的产物萃取手段中，会涉及到催化剂残留问题，酶作为一种外源性生物大分子，可能会引起诸多不良反应，与药品安全性密切相关。以合成总路线中，需要使用到多步酶法反应的阿托伐他汀中间体a8(cas号：209995-38-0)为例(路线如下)，a8难溶于水，通用的bradford或bca法或lowry法均不适用于该产品中的酶残留测定，因此，从药品质控角度和法规要求考虑，均有必要严格监控终产品中酶残留量，因此，酶残留检测方法的开发是非常有必要的。cn110954392a提供了一种酶法制备头孢丙烯中酶蛋白残留的检测方法，该方法以braford法作为原有方法，在此基础上添加了一步碳酸氢钠促溶解的方法进行头孢丙烯中的蛋白残留检测。该方法在碳酸氢钠能够促进溶解的供试品中有很好的检测效果，但很多化药中间体或原料药并不溶于水，也不能够被碳酸氢钠促溶。因此针对该类供试品，开发一种能够检测化药合成中的酶残留量的方法，是非常具有实用意义的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法，对单相bca检测体系进行了改进，该方法通过有机相(甲醇、乙醇等)与水相互溶的体系作为供试品的检测溶液，解决了大部分医药中间体均不能很好的水溶，无法使用常规方法进行其酶蛋白残留检测的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法，包括以下步骤：(1)配制两种工作液配置a、b两种工作液，工作液a：1.4gbca二钠盐，2.8g无水碳酸钠，0.224g酒石酸钠，0.56g氢氧化钠，1.33g碳酸氢钠定容至100ml；工作液b：0.56g硫酸铜加水定容至100ml；将工作液a与工作液b以50：1充分混匀获得工作液c；取标准蛋白储备溶液bsa溶液，经过梯度稀释获得制备标准曲线的标准蛋白稀释液，将该稀释液与工作液c混匀，并添加一定体积的助溶剂混匀保温反应后，即可得标准曲线溶液；(3)制备供试品测定溶液将一定量的医药中间供试品溶解于助溶剂中，与等体积工作液c混匀后，纯水补齐与制备标准曲线溶液体积等同后，进行保温反应，作为供试品测定溶液；(4)制备空白溶液取与上述标准曲线溶液等体积的工作液c、助溶剂混匀后，纯水补齐与制备标准曲线溶液体积等同后，进行保温反应，作为空白溶液对照；(5)计算酶蛋白残留量使用酶标仪作为检测仪器，选用562nm作为检测波长，通过空白溶液扣除本底，采用标准曲线溶液测定吸光度值，同时添加供试品测定溶液，在同等条件下测定吸光度值，根据标准曲线溶液吸光度值自动生成标准曲线，同时计算出供试品中的酶蛋白残留量。其中，所述助溶剂在测定溶液占总体积比为10％～70％。其中，每220μl测定溶液中的所述医药中间体供试品的添加量为1～100mg。其中，所述助溶剂为甲醇、乙醇或dmso。其中，所述保温反应时间为20～40min，保温温度为30～50℃。与现有技术相比，本发明的有益效果是：该方法打破了常规只能水相检测蛋白的壁垒，通过双相体系作为供试品的检测溶液，解决了大部分医药中间体均不能很好的水溶，无法使用常规方法进行其酶蛋白残留检测的问题。该方法操作简单，试剂耗材经济实惠，重现性较好，准确性高，是一种经济化的通用检测方法。附图说明图1为实施例1的标准曲线图；图2为实施例2的标准曲线图；图3为实施例3的标准曲线图；图4为对比例的标准曲线图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例160％甲醇添加量，酶残留测定以a8：(4r-cis)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯为例，进行酶残留测定，具体步骤为：(1)溶液配制工作液a：配制1.4％bca二钠盐，2.8％无水碳酸钠，0.224％酒石酸钠，0.56％氢氧化钠，1.33％碳酸氢钠定容至100ml，4℃保存待用。工作液b：配制0.56％硫酸铜定容至100ml，4℃保存待用。工作液c：工作液a：工作液b＝50：1进行混溶后获得工作液c，备用。bsa溶液：配置1mg/mlbsa溶液，4℃保存待用。供试品a8-甲醇待测液：称取供试品a80.6060g，用甲醇溶解定容至20ml，配制成a8-甲醇溶液。(2)绘制标准曲线以bsa为绘制标准曲线的标准蛋白，进行标准曲线绘制。其中，取标准蛋白储备溶液bsa溶液，经过梯度稀释获得制备标准曲线的标准蛋白稀释液，将该稀释液与工作液c混匀，并添加一定体积的助溶剂混匀保温反应后，即可得标准曲线溶液。孔号12345678bsa/μl024816243240去离子水/μl40383632241680工作液c/μl400400400400400400400400a8-甲醇待测液/μl660660660660660660660660体系/μl1100110011001100110011001100110038℃，保温30min。取220μl添加至96孔酶标板，使用酶标仪epoch，进行562nm处检测。获得标准曲线如图1。曲线名称曲线公式abr2标准曲线y＝a*x+b0.0120.0940.996(3)a8(4r-cis)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯酶残留测定分别取6组660μl步骤(1)配制的a8-甲醇待测溶液，加入到工作液c中，并添加40μl去离子水混匀后，保温反应37℃，30min后，取220μl至酶标板进行测量。孔号123456去离子水/μl404040404040工作液c/μl400400400400400400a8-甲醇待测溶液/μl660660660660660660体系/μl110011001100110011001100测量结果如下：(4)准确度考察在供试品中添加不同含量的bsa，测量回收率，并测量多组，进行准确度及重现性考察。结果如下：(5)lod与loq的计算配制10组空白样品：38℃，保温30min。取220μl添加至96孔酶标板，使用酶标仪epoch，进行562nm处检测并计算10组空白样品检测值的平均值和标准差，结果如下：平均值x0.0387标准差σ0.001059a(斜率)0.012(见步骤2)通过上述结果可以看出，该方法的检测限满足检测需求。实施例240％甲醇添加量下，标准曲线的建立(1)溶液配制工作液a：配制1.4％bca二钠盐，2.8％无水碳酸钠，0.224％酒石酸钠，0.56％氢氧化钠，1.33％碳酸氢钠定容至100ml，4℃保存待用。工作液b：配制0.56％硫酸铜定容至100ml，4℃保存待用。工作液c：工作液a：工作液b＝50：1进行混溶后获得工作液c，备用。bsa溶液：配置1mg/mlbsa溶液，4℃保存待用。(2)绘制标准曲线以bsa为绘制标准曲线的标准蛋白，进行标准曲线绘制。38℃，保温30min。取220μl添加至96孔酶标板，使用酶标仪epoch，进行562nm处检测。获得标准曲线如图2。曲线名称曲线公式abr2标准曲线y＝a*x+b0.01740.06830.996实施例380％甲醇添加量下，标准曲线的建立(1)溶液配制工作液a：配制1.4％bca二钠盐，2.8％无水碳酸钠，0.224％酒石酸钠，0.56％氢氧化钠，1.33％碳酸氢钠定容至100ml，4℃保存待用。工作液b：配制0.56％硫酸铜定容至100ml，4℃保存待用。工作液c：工作液a：工作液b＝50：1进行混溶后获得工作液c，备用。bsa溶液：配置1mg/mlbsa溶液，4℃保存待用。(2)绘制标准曲线以bsa为绘制标准曲线的标准蛋白，进行标准曲线绘制。孔号12345678bsa/μl01248121620去离子水/μl2019181612840工作液c/μl200200200200200200200200甲醇/μl880880880880880880880880体系/μl1100110011001100110011001100110038℃，保温30min。取200μl添加至96孔酶标板，使用酶标仪epoch，进行562nm处检测。获得标准曲线如图3。曲线名称曲线公式abr2标准曲线y＝a*x+b0.006420.02920.5结果：r2值过低，80％添加量不能准确测量供试品中低浓度的蛋白含量。对比例bradford法添加甲醇验证(1)溶液的准备bsa溶液：配置1mg/mlbsa溶液，4℃保存待用。市购2×bradfordreagent(诺唯赞)。(2)绘制标准曲线以bsa为绘制标准曲线的标准蛋白，进行标准曲线绘制。室温放置5min。取200μl添加至96孔酶标板，使用酶标仪epoch，进行595nm处检测。获得标准曲线如图4。曲线名称曲线公式abr2标准曲线y＝a*x+b0.004260.6160.756结果：添加甲醇检测酶残留的方法在bradford及其类似的考马斯亮蓝检测蛋白含量的方法中不适用。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12