通过LC-MS/MS法检测多肽药物的方法与流程

本发明涉及多肽药物检测，尤其是涉及通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法。

背景技术：

1、多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10-100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000。

2、常用生物基质中蛋白质多肤类药物的定量方法主要有免疫法等。免疫法利用抗原抗体特异性结合反应检测药物浓度，包括酶联免疫分析(elisa)放射分(ria)和分析(fia)等。

3、由于免疫法不能生成有关被分析物的化学信号，在分析过程中，可能会出现内源性抗体的干扰、非特异性结合及交叉免疫等问题，干扰试验结果。大多数免疫法仅能在较窄的线性范围内进行定量。免疫法不能使用内标，无法消除批间、批内差异，可能会影响准确度、精密度及重复性。

技术实现思路

1、1.要解决的技术问题

2、在现有检测方法中，免疫法会出现内源性抗体的干扰，无法使用内标，影响准确度、精密度及重复性的问题。

3、2.技术方案

4、为解决上述问题，本发明采用如下技术方案。

5、通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，所述方法包括以下步骤：

6、步骤1：蛋白沉淀：将多肽药物加入适量的缓冲液中直至ph值为7左右，加入反应剂溶液，加入量为多肽药物体积的10％-20％，在4℃的温度下静置0.5-1小时，使蛋白质充分沉淀至底部，用冷乙醇洗涤沉淀，去除残余的反应剂和其他杂质，将沉淀放入干燥器中,用低温低压的方式将水分脱除重溶，用适量的缓冲液将沉淀重溶，得到溶液；

7、步骤2：酶解：将步骤1制备的部分中加入二硫苏糖醇(dtt)进行还原，加入碘乙酰胺(ida)进行碱化，加入酶，混匀后在超声振荡器中震荡后，进行酶解；

8、步骤3：内标：将步骤2制备的部分中加入甲醛，在多肽n端通过还原反应进行二甲基标记；

9、步骤4：使用仪器：将步骤3制备的部分放入液相色谱-质谱联用仪，进行定量检测。

10、所述步骤1中所述缓冲液，为3-吗啉丙磺酸(mops)，所述步骤1中所述反应剂，为三氯醋酸(tca)，所述步骤4中所述液相色谱-质谱联用仪，为三重四级杆质谱仪(tq-ms)。

11、所述步骤2中，在进行超声震荡时，超声波的频率为15khz-40khz，所述步骤2中，在进行超声震荡时，向溶液中加入0.2-0.8％的丁醛，所述多肽药物，为内源性蛋白多肤类物，所述步骤2中，所述酶，为胰蛋白酶。

12、3.有益效果

13、相比于现有技术，本发明的优点在于：

14、lc-ms/ms法能够直接测定化合物本身，不依赖于化合物的结合特性，使内源性物质的干扰降低，分离能力、灵敏度和专属性高的效果。

技术特征：

1.通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述步骤1中所述缓冲液，为3-吗啉丙磺酸(mops)。

3.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述步骤1中所述反应剂，为三氯醋酸(tca)。

4.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述步骤4中所述液相色谱-质谱联用仪，为三重四级杆质谱仪(tq-ms)。

5.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述步骤2中，在进行超声震荡时，超声波的频率为15khz-40khz。

6.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述步骤2中，在进行超声震荡时，向溶液中加入0.2-0.8％的丁醛。

7.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述多肽药物，为内源性蛋白多肤类物。

8.根据权利要求1所述的通过lc-ms/ms法检测多肽药物的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述酶，为胰蛋白酶。

技术总结
本发明提供通过LC‑MS/MS法检测多肽药物的方法。该方法包括以下步骤1：蛋白沉淀：将多肽药物加入适量的缓冲液中直至pH值为7左右，加入反应剂溶液，使蛋白质充分沉淀至底部，用冷乙醇洗涤沉淀，用低温低压的方式将水分脱除重溶，用适量的缓冲液将沉淀重溶，得到溶液；步骤2：酶解：将步骤1制备的部分中加入二硫苏糖醇(DTT)进行还原，加入碘乙酰胺(IDA)进行碱化，加入胰蛋白酶进行酶解；步骤3：内标：将步骤2制备的部分中加入甲醛，在多肽N端通过还原反应进行二甲基标记；步骤4：使用仪器：将步骤3制备的部分放入液相色谱‑质谱联用仪，进行定量检测。本发明方法具有降低内源性物质的干扰，分离能力、灵敏度和专属性高的优点。

技术研发人员：郑毅
受保护的技术使用者：方临医药技术（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14