1、什么是VSV

2、VSV的基因组结构

3、VSV假病毒包装原理

4、VSV假病毒应用举例

什么是VSV

VSV是Vesicular stomatitis virus的缩写，中文名称为“水疱性口炎病毒”，属于水泡性病毒属，弹状病毒科（Rhabdoviridae），其外形如同其名字呈现出子弹型。

水泡性口炎病毒负染照片

弹状病毒的宿主范围很广，包括哺乳动物、鱼类、植物和昆虫等；很多弹状病毒是动植物的病原。弹状病毒属于弹状病毒科，下辖多种病毒属：

弹状病毒举例

VSV能感染牛、马、羊和猪等多种动物并致病，表现为足部和口部病变，其症状和手足口病相似。这种疾病可能降低奶制品和肉制品产量，加上必要的检疫隔离和贸易壁垒等，导致严重的经济损失。VSV主要流行于热带和某些温带地区，英国尚未出现该病毒感染的报道。

VSV的宿主范围极其广泛。除了家畜，蝙蝠、鹿和猴子等许多野生动物体内都检测到VSV中和抗体存在，表明这些动物同样会感染VSV。此外，蚊子、沙蝇和黑蝇等多种昆虫体内也分离到该病毒。目前，VSV在自然条件下的传播循环机制尚不明确。有理论认为，VSV可能通过一种或多种昆虫媒介在哺乳动物间传播。

人对此病毒易感，引起流感样症状，多数人一周内康复，可产生中和抗体。

实验室条件下，哺乳动物、鸟类、鱼类昆虫和线虫等来源的多种细胞都能够支持VSV的复制。相比于狂犬病毒，VSV的安全等级较低，比较容易开展研究。目前关于弹状病毒结构和复制机制的大多数认知都是基于VSV的研究。

VSV的基因组结构

野生型的VSV是一种由包膜病毒，其病毒体结构呈弹状或杆状，拥有一条单链负义RNA基因组（-ssRNA），并且其复制依赖病毒的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。含有5种结构蛋白：核蛋白（N），磷酸化蛋白质（P），RNA聚合酶（L），基质蛋白（M）以及糖蛋白（G）。

VSV病毒颗粒中，其RNA基因组与N核蛋白组成核糖核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）。其中，核苷酸与N蛋白的比例约为9:1。

P和L蛋白则组成RdRp，并结合于RNP。L蛋白因为其分子量巨大而得名，几乎一半的病毒基因组用于编码该蛋白。L蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，能够催化病毒基因组的转录过程。但是只有当P蛋白以3:1的比例与L蛋白结合的时候，L蛋白才具有聚合酶活性。L蛋白还能催化mRNA的加帽和多聚腺苷酸化。

VSV感染靶细胞时，其G糖蛋白诱导细胞发生内吞作用，帮助病毒侵入细胞。G糖蛋白可以介导病毒包膜与细胞膜融合，促使RNP和RdRp一起释放到细胞质中。病毒组分进入细胞后，RdRp以RNP中的负义RNA基因组为模板立即启动一级转录，而作为转录产物的正义RNA链被进一步翻译，用于生产介导病毒基因组复制、二级转录、病毒组装和出芽等病毒等功能的后期蛋白。

病毒蛋白开始合成后，N、P及L蛋白会逐渐积累并形成内含体。之后，病毒RNA在内含体中进行复制。复制过程中，病毒需要首先合成与负链基因组互补的(+)RNA分子，再以之为模板合成基因组RNA。（-）RNA有三重作用：其中部分作为模板合成新的(+)RNA，另部分作为模板再次进行转录(二次转录)，还有一部分则作为基因组包装到子代病毒中。只有（-）RNA才能包装进入子代病毒，因为（-）RNA5'末端具有包装信号。

VSV的其他4种蛋白质的翻译过程都发生在细胞质游离的核糖体上，只有G蛋白例外，G蛋白在粗面内质网（ER）进行翻译，最后在高尔基体中修饰成熟。

M蛋白在病毒装配过程中起着重要作用。一方面它能够将核衣壳压缩成紧实的螺旋结构，另一方面能够指导核衣结合到G蛋白大量表达的细胞质膜区域。随后，病毒从这些质膜区域出芽，从而获得囊膜。M蛋白拥有一个晚期结构域(L)能够与出芽相关的宿主蛋白相结合。

M蛋白除了在病毒装配过程中起关键作用，在抑制宿主基因表达过程也很重要。在感染早期，M蛋白大部分滞留在内吞体，还有小部分M蛋白释放到细胞质中并转运至细胞核，M蛋白能够抑制宿主的3种RNA聚合酶的转录，从而阻断宿舍细胞基因的表达。在动物细胞中，干扰素的合成收到抑制就是M蛋白这些功能综合作用的结果之一。

了解了VSV的感染复制过程，那么我们也可以像慢病毒以及腺病毒包装一样利用VSV包装成假病毒颗粒，制备假型病毒，研究病毒进入细胞及传染机制。

VSV假病毒包装原理

水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）载体在研究病毒颗粒入侵宿主细胞、辨认介导病毒感染细胞的细胞表面受体、筛选病毒抑制药物以及疫苗开发方面有着广泛的应用。VSV病毒载体可以高效地利用异源病毒的包膜蛋白进行假型化（Presudotypted），比如那些需要在高生物安全等级实验室操作的病毒的包膜蛋白。

重组VSV是G糖蛋白基因缺失的，该缺失导致VSV自我复制缺陷的。G糖蛋白基因通常被替换为报告基因（如荧光蛋白基因、荧光素酶报告基因或分泌型碱性磷酸酶基因）用于病毒的转导效果测定。

生产VSV假病毒主要由三个步骤构成：1. 使用质粒初步制备VSV；2. 扩增G糖蛋白补全的VSV；3. 使用异源病毒的包膜蛋白组装VSV假病毒。

进行重组VSV初步制备时，首先利用大肠杆菌构建一个可转录编码VSV基因组的负义RNA链的VSV-ΔG转移质粒，其转录产物作为RdRp合成病毒RNA的RNA模板。该载体与四个辅助载体（分别表达VSV N、P、G和L蛋白）共转染至经牛痘病毒接种的表达噬菌体T7 RNA聚合酶的包装细胞【T7等噬菌体的RNA聚合酶是原核类表达载体的基础,因真核mRNA在结构,转录及加工上与原核不同,所以很难将该酶用于真核细胞。将T7RNA聚合酶基因整合到牛痘病毒基因组中(可在细胞质中复制的DNA病毒),就不需在核中合成再转运的过程。】。T7 RNA聚合酶作用于转移质粒上的T7启动子，驱动VSV-ΔG基因组转录出负义RNA。重组VSV在包装细胞中组装并释放。收集细胞上清，用其再次感染表达有G糖蛋白的包装细胞，获得高产量的G糖蛋白补全的重组VSV。VSV假病毒随后通过转导G糖蛋白补全的VSV至表达有异源病毒包膜蛋白的包装细胞的方式制备。

VSV假病毒应用举例

VSV转移质粒删除了VSV的G糖蛋白基因，因此可通过提供异源病毒包膜糖蛋白的顺式元件来组装VSV假病毒。

2019年12月FDA批准全球首个埃博拉疫苗-Ervebo V920就是基于此原理而研发而成，通过反向遗传操作，将 EBOV GP蛋白替换VSV的G蛋白获得的重组VSV，改造之后的VSV疫苗既能让机体产生针对埃博拉病毒的抗体，同时又没有致病性。

另外，我们还可以将VSV-G蛋白替换成SARS-CoV-2的S蛋白获得的重组VSV，S蛋白包被的假病毒可以模拟冠状病毒结合细胞表面受体进入细胞的过程。

冠状病毒的刺突蛋白（S蛋白）在病毒包膜外产生刺突形状并形成花冠一样的结构，冠状病毒的名称由此而来。这些刺突首先帮助病毒依附在宿主细胞表面，然后介导病毒包膜与细胞膜的融合从而让病毒颗粒进入细胞。

冠状病毒包含大量的拥有不同宿主嗜性的病毒类型。一种给定的冠状病毒通常只能有效感染一种或几种宿主，这是由于一种给定病毒类型的S蛋白只能特异地与它的宿主受体结合导致的。比如说，SARS-CoV和SARS-CoV-2，可分别引起SARS和COVID-19，它们的S蛋白通过与人类呼吸道、肺以及上皮细胞的表面ACE2受体结合感染人类。另一方面，MERS-CoV，引起了MERS，通过与人DDP4受体结合进入人体细胞。

对于理解冠状病毒如何进入细胞，以及一种嗜性的冠状病毒如何演化导致病毒可以从一种宿主跨物种感染至另一种宿主的背后机制，研究不同冠状病毒的S蛋白如何与它们的宿主受体结合是十分重要的。但是这样的研究通常难以实施，这是因为一些有活性的冠状病毒毒株是危险的，比如说SARS-CoV-2这种病毒只能在生物安全三级（BSL-3）的实验室进行操作。

作为使用活性冠状病毒的替代方案，使用慢病毒、VSV病毒等工具病毒进行人工重组获得的S蛋白假病毒是一个更可行的方向。这些工具病毒与冠状病毒一样都是包膜病毒，冠状病毒的S蛋白可以同样被引入到工具病毒的包膜结构上。以S蛋白包被的假病毒可以模拟冠状病毒结合细胞表面受体进入细胞的过程。用于制备假病毒的工具病毒本身是十分安全的，可以整合任何类型的冠状病毒的野生型或者突变型的S蛋白。

使用ACE2过表达细胞株进行S蛋白假病毒转导。同时引入EGFP或者荧光素酶，从而实现对病毒进入宿主细胞的过程监测。

生产重组VSV有相当多的中间步骤，包括从质粒初步制备VSV、斑块纯化、生产G糖蛋白补全的VSV、使用异源病毒的包膜蛋白组装VSV假病毒等。这些步骤相对于传统的质粒转染要求运用到更复杂的技术。