人造海水的配方

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1、人造海水的配方*(引自 Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996 :水&化合物的总重量为1kg.名称质量(x 10-3kg)氯化钠23.98氯化镁5.029硫酸钠4.01氯化钙1.14氯化钾0.699重碳酸钠0.172溴化钾0.100硼酸0.0254氯化锶0.0143氟化钠0.0029water. ASW) 人工海水的组成(Lyman and Flemingt 1940)如下0NaCI24.477sMgCb诵再。44妣罠N 恕 SO*CflCirHjO1 J020gKCI0.6640gNaHClJOJ920gKBrHjIK

2、Kj0,0260ftSrCl20.024l*gNaF0.0039s攜懐欧1 CJOOml为了避免沉淀的产生*人工海水的各成分需要分别濬解*然后殍混合；pH*7仏可以用玻的氢匏化钠或盐酸来调节。用以上人工梅水代替天然悔水大大方便了实弊聿条件下对真菌的培养，使海海洋微生物及其代谢产物-林永成主编2003细菌的分离：牛肉膏蛋白胨琼脂、营养琼脂等是分离细菌的常用培养基，前苏联细菌学家设计 的ZOBELL 2216E培养基是培养好气性异养细菌较好的培养基，可培养多种细 菌，SIMIDU培养基也常用于海洋好气性异养细菌的分离，PFENNIGS 用于海洋光合细菌的分离，分离海洋弧菌可采用 TCBS培为7.2

3、-7.6,盐度为28到30,培养温度28到37，培养时间1到7天，注意观察 平板菌落变化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小菌落，为防止真菌 的污染，常在培养基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、两性霉素、放线 菌酮等。放线菌因生长缓慢且菌落不大，一般不会对细菌的分离产生影响。放线菌的分离：1放线菌是数量最多、最常分离到的 G+ JENSEN勺研究表明，离海岸越近，在 0到1米水深的底泥样本中，链霉菌占分离的放线菌总数的86%小单抱菌占12% 其他占2%2分离培养基多采用合成培养基(高氏合成一号、精氨酸、天门冬素培养基)和有机培养基(HV YE、WAKSMAhbennett ),高氏合

4、成一号是分离的常用培养基，适合尤其是链霉 菌的生长，但细菌和真菌也大量生长。HV是以腐植酸为唯一碳、氮源的培养基， 对小单抱菌、小双抱菌、指抱囊菌、链抱囊菌的选择性高，但是生长的放线菌形 态不完整，难以观察，给挑菌工作带来困难。3抑制剂放线菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、链霉素可抑制细菌，重铬酸钾对真菌 和细菌均可抑制，0 005%-001淞较理想的分离抑制剂，有三个特点：抑制细 菌和真菌的生长，不影响放线菌的正常生长，还可促进一些放线菌抱子的萌发， 价格低廉。4样品预处理120干热处理样品1小时能大大减少细菌和链霉菌的数量，而对稀有放线菌影响 较少，甚至能利于抱子萌发，由于海洋样品多潮湿，

5、同时抱子对湿热敏感，故米 用50到55度的热处理会促使大部分抱子萌发。化学杀菌剂法杀菌剂 氯化钙苯酚 SDS葡萄糖酸洗必泰 CG 苄索氯氨BC碳酸钙富集的放线菌 囊抱菌非链霉菌属小单抱菌智小双抱菌非链霉菌属小四抱菌所有放线困放线双抱菌 小四抱菌链抱囊菌差速离心浓缩真菌的分离：到2000年止已认知的海洋真菌仅仅 444种，包括177属360种的子囊菌（占81 1%，51属74种半知菌（占16 7%和7属10种的担子菌（占2 2% 选择性富集海水样品可通过浓缩或过滤，用无菌的045卩厨1径的硝酸纤维素滤膜过滤海水， 然后直接把滤膜放在培养基上培养。分离酵母菌时，可将含 50-200哑/L氯霉素的分

6、离培养基用浓盐酸调PH值至3 4酸性条件下可抑制很多细菌生长。植物内生真菌分离方法：进行分离前，对植物材料表面进行彻底消毒非常必要，典型的消毒剂有70%-90%的乙醇、漂白剂、1%勺过氧乙酸和3%-30%勺过氧化氢，多采用 PDA培养基，并 加入庆大霉素、氯霉素、链霉素等抗生素，抑制细菌和放线菌的生长。鉴定：16S rRNA相对分子量适中，易于进行序列测定和分析比较，可以为细菌鉴定提 供相对稳定可靠的信息，广泛用于评价生物遗传多态性和系统发生关系。18SrRNA成为目前研究真菌属物种多样性的分析比较。原核微生物rRNA包含23S16S、5S,真核微生物转录区包含 5S、18S、5 8S、28S

7、。（C+G mol%在种内不超过4%属内不超过10%低于2%没有分内学意义。只具 有否定价值，需与表型特征相结合。16S rDNA成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，适用种及种以上的分类单位。同源性95%的菌可归为同一属， 97如视为同一种，大于 97%寸必须测定 DNA-DN杂交率是否大于70%才能确定是否为新种。由于对同种内的不同菌株分辨力较差，更适合研究属及属以上的菌株。18S rDNA普遍用于真菌物种的鉴定分析。植物内生真菌的分离 叶、叶脉、茎、树皮（韧皮部）等样品用自来水冲洗掉泥土， 然后进行严格的表面消毒程序：依次浸泡在75%酒精lmin , 3%5%有效氯的次 氯酸钠溶液3 min

8、。75%的酒精O 5 min,然后再用无菌水冲洗3遍。晾干后，在 超静台将其剪成约O. 5 cmx 0. 5 cm左右小片。将处理好后剪成的小片铺于 PDA 平板上，加入氯霉素与链霉素各50斗g/mL抑制细菌的生长，在26C培养培养2 3周分离内生真菌。这些平板在第1周要每天检查1次，然后可以3、4 d检查1 次。一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上，经几 次纯化保存于PDA斗面。植物组织样品处理：将采集的红树林植物样品先用流动的清水冲洗干净，再超声 清洗彻底去除植物组织表面的杂质，把植物样品剪切成15 cm左右长度的节段 进行表面消毒。样品依次用次氯酸钠（含5%有效氯

9、量）浸泡5 min,无菌水清洗3次, 75%酉精浸泡3 min,无菌水清洗3次,晾干，用粉碎机把植物组织粉碎备1,3.1各种样品预处理方法样禺悬浮液的直接制备;称取2 g样品（海生动植物体用无菌剪刀剪碎）到2。血的无菌海水中，旋涡振 10 mnt使梵充分混悬，SD5法处理样品岳称取2 g样品辉生动植物体用无菌剪刀剪碎到20汕含有0.05 % SDS和6 %酔母膏的无菌海水中，振荡3-5min后，409、200 r（nin r 下振蕩 30 odm苯酚法处理样品【I叭称2 g样品（海生动植物体用无菌剪刀剪碎）到含有L5 %苯酚的20 mL的无凿禅水中，振荡3-5 min后，30工 200 mif

10、下振蕩30 min*加热法处理样品I叫 将直接制备好的样品悬浮液55匸水浴6 min.（或5OV,】h）注意；样晶处理的軟个过程必级是无曲的表1-1两种分离筛选所用到的培养基名称配方%酵母粉-麦牙膏琼脂(YE)1,21酵母粉04.麦芽膏1,葡他糖0.4.琼脂2,陈海水 75.蒸憎水 25, pH： 7. 2-7. 4淀粉-干酪素琼脂(SC) 1,2 1,1可溶性淀粉h 干酪索0. 03, KNO, 0.2%9 NaCl0.2. K：PO0.002, FeS0 0.001,琼脂 2,放线菌崩 75ppo 陈海水75.蒸烤水25. pH: 7. 2-7. 4彻萄糖-天门冬酰氨彌萄糖L 天门冬酰訊0

11、.05,磷酸耗二钾0.05.琼曆(GA) HV的配制：称取腐植酸加1%的1ICL.煮沸后过滤取上清：各种维生索与堵养基其 他成分开灭葡，倒皿前加入. 以上培养基除GA要求115*C下，灭菌30 min夕卜，其余培养基均是121,灭曲 21 nin. 加入750 ppm放线菌酮的YE、SC、GA. HV用于涂布预处理后的样品；加入100 ppm重锯酸钾的YE, Gause用于扳辂酸钾选择法，不加任何抑制剂或抗生素的YE、SC、 GA、HV作为对照不加任何抑制剂或抗生素的YE斜面用来探减放线菌和真菌-,2- 131琼脂2.陈海75.蒸憾水25. pH: 7. 2-7. 4腐殖酸-维生素琼脂(HV) 1,41腐殖联 0. 1. N&HPOi 0.005. KC1 0. 17 . MgSO蒸IS 水 25. pH:7. 2-7.4淀粉蛋白腺琼脂(Ml) ,s,可溶性淀粉0. 25,蛋白籐0.1,酵母粉0.05甘油确酸二钠0.01,琼脂厶 陈海水75蒸懈水pH7. 2-7.4葡萄糖蛋白腺(Martin) ,u,葡萄糖10蛋白陈0.5, KH,PO 1.0.MgSOWHxO 0. 05琼脂 2. pH:7.2-7.4淀粉黃豆粉液体发酵培养基可溶性淀粉2,黄豆粉抽提物1.5,(SLM) 1161酵即粉05. CaCO, 0. 4.陈海水75.蒸炮水 25. pH:7. 2-7.4